腦內(nèi)Toll樣受體4信號(hào)在宮內(nèi)感染致新生大鼠腦白質(zhì)損傷中作用的研究.pdf

1、目的：
　　 早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷(white matter damage，WMD)被認(rèn)為是早產(chǎn)兒最主要也是最重要的腦損傷。WMD的關(guān)鍵性性細(xì)胞是少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。最近有學(xué)說(shuō)指出WMD的發(fā)病機(jī)制中存在少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化障礙。流行病學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均表明官內(nèi)感染是早產(chǎn)兒WMD發(fā)生的主要因素之一。神經(jīng)免疫應(yīng)答反應(yīng)被認(rèn)為在官內(nèi)感染和早產(chǎn)兒WMD中起重要的介導(dǎo)作用。但具體的分子機(jī)制目前還不明確。
　　 Toll樣蛋白的研究是近年來(lái)

2、炎癥信號(hào)傳導(dǎo)領(lǐng)域取得的最重要進(jìn)展。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)激活后通過(guò)誘導(dǎo)一系列炎性相關(guān)因子的表達(dá)調(diào)控機(jī)體固有性免疫應(yīng)答，并最終激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答。研究指出TLR-4信號(hào)通路參與缺血性腦梗塞、腦挫傷、帕金森氏病、蛛網(wǎng)膜下腔出血、多發(fā)性硬化、缺氧性腦損傷等一系列免疫應(yīng)答相關(guān)性腦損傷的發(fā)生。因此有學(xué)者提出：神經(jīng)免疫應(yīng)答過(guò)程中小膠質(zhì)細(xì)胞TLR-4信號(hào)的表達(dá)啟動(dòng)在腦內(nèi)防御反應(yīng)及腦損傷的平衡機(jī)制中起重要作用。最

3、新的研究還指出TLR-4信號(hào)能直接激活經(jīng)典的notchl信號(hào)通路分子。而Notchl信號(hào)通路通過(guò)其下游目的基因Hes（Hairy enhancer of split）基因家族（如Hesl、Hes5等）對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化起到重要的負(fù)性調(diào)控作用。
　　 目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于TLR-4信號(hào)在官內(nèi)感染致WMD發(fā)生中作用的研究不多，且多集中在離體水平上。過(guò)去幾年間，我們實(shí)驗(yàn)室通過(guò)子宮頸內(nèi)接種大腸桿菌的方式成功建立了官內(nèi)感染致新生大鼠WMD的動(dòng)物

4、模型?；谶@一成熟模型，本研究觀察宮內(nèi)感染后仔鼠腦內(nèi)TLR-4信號(hào)分子表達(dá)。并通過(guò)檢測(cè)相關(guān)下游細(xì)胞因子、少突膠質(zhì)細(xì)胞分化負(fù)性調(diào)控因子，進(jìn)一步探討TLR-4信號(hào)在官內(nèi)感染致WMD中的作用機(jī)制。該研究為臨床治療早產(chǎn)兒WMD提供豐富的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)信息及依據(jù)，為今后相關(guān)領(lǐng)域深入研究奠定整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步研究早產(chǎn)兒WMD的防治提供新的靶點(diǎn)。
　　 方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)分組：將孕鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、宮內(nèi)感染組。宮內(nèi)感染組孕齡1

5、5天的孕鼠宮頸左右兩側(cè)各注射大腸桿菌稀釋液0.2 ml，對(duì)照組同孕齡孕鼠注入等量生理鹽水。
　　 2.標(biāo)本采集：選擇17、19、21天胎齡和新生1、3、7、14日齡為觀察時(shí)點(diǎn)，剖腹取出胎鼠或者隨機(jī)選取各組新生仔鼠斷頭處死，取出腦組織置于10％中性甲醛或液氮速凍后-80℃超低溫冰箱中冷凍保存。
　　 3.實(shí)驗(yàn)方法：測(cè)定各時(shí)點(diǎn)仔鼠體重、腦重。應(yīng)用蘇木素-伊紅(hematoxylineosin，HE)染色觀察各組新生1、3、7

6、、14日齡大鼠腦室周?chē)踪|(zhì)組織病理變化特點(diǎn)。Western blot檢測(cè)各時(shí)點(diǎn)仔鼠腦組織髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)、TLR-4和核因子kappa B p65(nuclear factor-kappa B p65，NF-rB p65)的蛋白表達(dá)水平，熒光定量RT-PCR檢測(cè)各時(shí)點(diǎn)仔鼠腦內(nèi)TLR-4、NF-kB p65、細(xì)胞因子腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α、白細(xì)

7、胞介素（interieukin，IL）-1β、Notchl、Hes5 mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.44只孕鼠活動(dòng)、進(jìn)食均正常，無(wú)l例發(fā)生死亡、早產(chǎn)。仔鼠情況：對(duì)照組獲取新生仔鼠66只，17、19、21天胎齡仔鼠56、55、58只，死產(chǎn)2只，死胎7只；宮內(nèi)感染組獲取新生仔鼠70只，17天、19天、21天胎齡仔鼠57、58、56只，死產(chǎn)5只，死胎8只.
　　 宮內(nèi)大腸桿菌感染的孕鼠子宮壁及胎盤(pán)內(nèi)血管充血

8、、水腫，并見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)照組的孕鼠子宮及病理檢測(cè)均未見(jiàn)明顯的炎癥反應(yīng)。
　　 2.宮內(nèi)感染后，各時(shí)點(diǎn)胎鼠及1日齡仔鼠體重、腦重下降.
　　 3.7、14日齡仔鼠腦室周?chē)踪|(zhì)部位HE染色可見(jiàn)：對(duì)照組腦白質(zhì)組織結(jié)構(gòu)正常，染色清晰；宮內(nèi)感染組腦白質(zhì)染色淡，結(jié)構(gòu)稀疏呈篩網(wǎng)狀改變。
　　 4.對(duì)照組14日齡仔鼠腦組織出現(xiàn)MBP表達(dá)，宮內(nèi)感染組14日齡仔鼠腦組織MBP表達(dá)減少甚至消失。
　　 5.宮內(nèi)感染后

9、TLR-4及其下游信號(hào)分子NF-kB p65表達(dá)在17日胎齡及1、3、7日齡仔鼠腦內(nèi)同步化上調(diào)。
　　 6.宮內(nèi)感染后19、21天胎齡仔鼠腦內(nèi)TNF-α表達(dá)上調(diào)。
　　 7.宮內(nèi)感染后Notchl及其下游信號(hào)分子Hes5表達(dá)在19日胎齡及1、3、7日齡仔鼠腦內(nèi)同步化上調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1.宮內(nèi)感染可使胎鼠體重、腦重下降。
　　 2.TLR-4信號(hào)可能參與宮內(nèi)感染致WMD的發(fā)生。