TSLP-TSLPR-STAT5和TLR2-MyD88-NFκB-p65信號通路在角膜上皮細胞抗煙曲霉菌感染免疫調(diào)控作用.pdf

1、真菌性角膜炎是一種嚴重的眼部感染性疾病，近年來其發(fā)病率不斷上升。真菌感染引起角膜潰瘍是導致失明的重要原因。角膜細胞是角膜天然免疫的一道重要防線，角膜細胞并非傳統(tǒng)意義的免疫細胞，但細胞上的某些受體可以快速識別真菌并抵御其入侵，發(fā)揮免疫作用。胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(thymicstromal lymphopoetin，TSLP)，是一種新型的與Th2介導的過敏性疾病相關聯(lián)的細胞因子。已有研究表明角膜細胞通過TLR/NFκB信號通路合成并分泌

2、TSLP，但TSLP是否可以直接作用于角膜細胞并在角膜細胞抗真菌免疫中發(fā)揮作用及其作用機制尚無具體研究。
　　目的:研究TSLP/TSLPR/STAT5和TLR2/MyD88/NFκB-p65信號通路在人角膜上皮細胞抗煙曲霉菌感染中的相互作用。
　　方法:將培養(yǎng)的人永生化角膜上皮細胞(telomerase-immortalized human cornealepithelial cells，THCEs)以1×105個/孔的密

3、度種植到六孔板上，用106個/ml的20-40μm煙曲霉菌菌絲片段刺激液刺激人永生化角膜上皮細胞，刺激后不同時間點(30min，1h，3h，6h，12h，24h，48h)收細胞，RT-PCR檢測信號通路分子TSLP受體(TSLP receptor, TSLPR)、IL-7Rα;刺激后12h收細胞，RT-PCR和ELISA檢測 TSLP的表達，Western Blot檢測TSLPR、 p-STAT5和STAT5蛋白表達;刺激后12h細胞免

4、疫熒光檢測轉(zhuǎn)錄因子p-STAT5向細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移。用10 mg/ml的酵母聚糖刺激人永生化角膜上皮細胞，刺激后不同時間點(1h，3h，6h，12h，24h，48h)收取細胞，RT-PCR檢測信號通路分子TSLPR;刺激后12h收細胞和細胞上清液，RT-PCR和ELISA檢測TSLP的表達;刺激后48h收細胞，Western Blot檢測TSLPR、p-STAT5和STAT5蛋白表達。單克隆抗體封閉人永生化角膜上皮細胞表面TLR2受體，煙

5、曲霉菌刺激12h收細胞和細胞上清液，RT-PCR和ELISA檢測TSLP的表達，Western Blot檢測TSLPR、p-STAT5和STAT5蛋白表達;人重組TSLP蛋白刺激人永生化角膜上皮細胞，刺激后不同時間點(30min，1h，3h，6h)收取細胞，RT-PCR檢測MyD88;刺激后3h，Western Blot檢測NFκ B-p65的蛋白表達。siRNA敲減TSLP后，煙曲霉菌刺激人永生化角膜上皮細胞，刺激后不同時間點(30m

6、in，1h，3h，6h)收取細胞，RT-PCR檢測MyD88;刺激后3h，Western Blot檢測NFκ B-p65的蛋白表達。
　　結果:煙曲霉菌菌絲刺激人永生化角膜上皮細胞后，TSLPR和p-STAT5表達增多。酵母聚糖刺激人永生化角膜上皮細胞后，TSLPR和p-STAT5的表達也增多;TLR2單克隆抗體封閉TLR2后，煙曲霉菌活化的TSLP下游信號通路分子TSLPR和p-STAT5的表達減少。人重組TSLP蛋白促進角膜上