TSLP-TSLPR-STAT5和TLR2-MyD88-NFκB-p65信號(hào)通路在角膜上皮細(xì)胞抗煙曲霉菌感染免疫調(diào)控作用.pdf

1、真菌性角膜炎是一種嚴(yán)重的眼部感染性疾病，近年來其發(fā)病率不斷上升。真菌感染引起角膜潰瘍是導(dǎo)致失明的重要原因。角膜細(xì)胞是角膜天然免疫的一道重要防線，角膜細(xì)胞并非傳統(tǒng)意義的免疫細(xì)胞，但細(xì)胞上的某些受體可以快速識(shí)別真菌并抵御其入侵，發(fā)揮免疫作用。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymicstromal lymphopoetin，TSLP)，是一種新型的與Th2介導(dǎo)的過敏性疾病相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞因子。已有研究表明角膜細(xì)胞通過TLR/NFκB信號(hào)通路合成并分泌

2、TSLP，但TSLP是否可以直接作用于角膜細(xì)胞并在角膜細(xì)胞抗真菌免疫中發(fā)揮作用及其作用機(jī)制尚無具體研究。
　　目的:研究TSLP/TSLPR/STAT5和TLR2/MyD88/NFκB-p65信號(hào)通路在人角膜上皮細(xì)胞抗煙曲霉菌感染中的相互作用。
　　方法:將培養(yǎng)的人永生化角膜上皮細(xì)胞(telomerase-immortalized human cornealepithelial cells，THCEs)以1×105個(gè)/孔的密

3、度種植到六孔板上，用106個(gè)/ml的20-40μm煙曲霉菌菌絲片段刺激液刺激人永生化角膜上皮細(xì)胞，刺激后不同時(shí)間點(diǎn)(30min，1h，3h，6h，12h，24h，48h)收細(xì)胞，RT-PCR檢測信號(hào)通路分子TSLP受體(TSLP receptor, TSLPR)、IL-7Rα;刺激后12h收細(xì)胞，RT-PCR和ELISA檢測 TSLP的表達(dá)，Western Blot檢測TSLPR、 p-STAT5和STAT5蛋白表達(dá);刺激后12h細(xì)胞免

4、疫熒光檢測轉(zhuǎn)錄因子p-STAT5向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移。用10 mg/ml的酵母聚糖刺激人永生化角膜上皮細(xì)胞，刺激后不同時(shí)間點(diǎn)(1h，3h，6h，12h，24h，48h)收取細(xì)胞，RT-PCR檢測信號(hào)通路分子TSLPR;刺激后12h收細(xì)胞和細(xì)胞上清液，RT-PCR和ELISA檢測TSLP的表達(dá);刺激后48h收細(xì)胞，Western Blot檢測TSLPR、p-STAT5和STAT5蛋白表達(dá)。單克隆抗體封閉人永生化角膜上皮細(xì)胞表面TLR2受體，煙

5、曲霉菌刺激12h收細(xì)胞和細(xì)胞上清液，RT-PCR和ELISA檢測TSLP的表達(dá)，Western Blot檢測TSLPR、p-STAT5和STAT5蛋白表達(dá);人重組TSLP蛋白刺激人永生化角膜上皮細(xì)胞，刺激后不同時(shí)間點(diǎn)(30min，1h，3h，6h)收取細(xì)胞，RT-PCR檢測MyD88;刺激后3h，Western Blot檢測NFκ B-p65的蛋白表達(dá)。siRNA敲減TSLP后，煙曲霉菌刺激人永生化角膜上皮細(xì)胞，刺激后不同時(shí)間點(diǎn)(30m

6、in，1h，3h，6h)收取細(xì)胞，RT-PCR檢測MyD88;刺激后3h，Western Blot檢測NFκ B-p65的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:煙曲霉菌菌絲刺激人永生化角膜上皮細(xì)胞后，TSLPR和p-STAT5表達(dá)增多。酵母聚糖刺激人永生化角膜上皮細(xì)胞后，TSLPR和p-STAT5的表達(dá)也增多;TLR2單克隆抗體封閉TLR2后，煙曲霉菌活化的TSLP下游信號(hào)通路分子TSLPR和p-STAT5的表達(dá)減少。人重組TSLP蛋白促進(jìn)角膜上