PMA-qPCR定量檢測(cè)畜禽肉類(lèi)中食源性致病菌活菌的研究.pdf

1、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌是兩大食源性致病菌。在我國(guó)由沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件主要因食入了受污染的畜禽肉類(lèi)食品為主。了解這兩類(lèi)食源性致病菌在畜禽肉類(lèi)食品中的污染程度，獲得其污染的定量數(shù)據(jù)，可為開(kāi)展食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供重要的科學(xué)依據(jù)。本研究旨在建立可快速、有效檢測(cè)沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的活菌定量檢測(cè)方法，并初步應(yīng)用于畜禽肉類(lèi)食品中此類(lèi)菌檢測(cè)，為食品安全快速定量檢測(cè)提供技術(shù)支持。
　　疊氮丙啶（PMA）作為一種與核酸

2、具有親和性的光敏性染料，具有活/死細(xì)胞篩選的功能。它可通過(guò)死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，對(duì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行不可逆修飾，使其不能進(jìn)行擴(kuò)增；而活細(xì)胞由于細(xì)胞膜完全阻止了PMA進(jìn)入胞內(nèi)，因此活細(xì)胞的DNA擴(kuò)增不受影響。PMA的選擇性功能與菌屬不同有關(guān)。本研究分別選取了革蘭氏陰性菌（沙門(mén)氏菌）和革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌）各一株，分別分析了PMA對(duì)兩種菌活/死細(xì)胞的選擇性作用。對(duì)PMA作用的幾個(gè)關(guān)鍵因素，包括曝光時(shí)間、最小抑制濃度、最大毒性濃

3、度等進(jìn)行了探索。通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析，確定5分鐘為適宜的曝光時(shí)間；沙門(mén)氏菌在PMA15μg/ml濃度下可完全抑制死菌DNA擴(kuò)增，大于40μg/ml濃度時(shí)可對(duì)活菌產(chǎn)生影響；金黃色葡萄球菌 PMA的最小抑制濃度為30μg/ml，最大毒性濃度為50μg/ml。
　　本研究將PMA與qPCR相結(jié)合，建立PMA-qPCR定量檢測(cè)方法，更好地發(fā)揮了qPCR快速定量的功能，且利用PMA對(duì)活/死細(xì)胞具有選擇性的特性，規(guī)避常規(guī)qPCR方法和培養(yǎng)計(jì)數(shù)法中出現(xiàn)

4、假陽(yáng)性和漏檢的情況，開(kāi)發(fā)快速準(zhǔn)確的活菌定量檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)靈敏度和特異性分析評(píng)估PMA-qPCR方法的可靠性。PMA-qPCR方法最低可檢出101CFU/ml沙門(mén)氏菌或金黃色葡萄球菌。
　　本研究還設(shè)計(jì)構(gòu)建了針對(duì)沙門(mén)氏菌invA基因特定序列的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品建立的qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)最低可檢出10copies/reaction(R2=0.9979)。構(gòu)建了含有金黃色葡萄球菌nuc基因特定序列的質(zhì)粒作為金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)方法的

5、標(biāo)準(zhǔn)品，所建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)R2為0.9973，可檢出14copies/reaction。質(zhì)粒的構(gòu)建為PMA-qPCR方法的穩(wěn)定性提供了保證。
　　本研究將PMA-qPCR活菌定量檢測(cè)方法應(yīng)用于畜禽肉類(lèi)食品樣本，通過(guò)對(duì)人工染菌的樣本進(jìn)行分析，對(duì)畜禽肉類(lèi)樣本中的沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測(cè)范圍在103～108CFU/ml。與傳統(tǒng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)法進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，沙門(mén)氏菌活菌定量檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)法結(jié)果、金黃色葡萄球菌與紙片計(jì)數(shù)法結(jié)果均無(wú)統(tǒng)