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文檔簡介
1、目的:⑴研究DA(柔紅霉素加阿糖胞苷)聯(lián)合化療加粒細胞集落刺激因子(G-CSF)方案(DAG)治療難治、復發(fā)性PNH的療效;⑵觀察PNH患者GPI-AP陽性和陰性的骨髓單個核細胞胞體外生長情況,比較兩者對DAG方案體外反應的差異。同時比較G-CSF對GPI-AP陽性和陰性細胞表面G-CSF受體(CD114)表達的影響。為探索PNH細胞克隆對DAG反應異常的機制,進一步分析PNH患者和正常對照及PNH患者體內GPI-AP陽性和陰性細胞表面
2、G-CSF受體(CD114)和黏附分子CD44/CD49d表達差異。⑶通過體外研究PNH患者骨髓單個核細胞在不同條件孵育后CD71+CD59表達水平的變化,分析PNH患者是否適合輸注“不洗滌”的紅細胞,為PNH患者輸血時選擇“洗滌”或“不洗滌”紅細胞提供理論依據(jù)。
方法:①對10例難治、復發(fā)性PNH患者采用DAG方案:柔紅霉素40mg第1、2天,20mg第3天,靜滴,共3天;阿糖胞苷100mg/d,靜滴,共5d-7d?;?/p>
3、當天同時應用G-CSF300 ug/d刺激造血直至患者度過骨髓抑制期,WBC恢復正常。觀察患者血象、溶血指標及外周血CD59-中性粒細胞比例、糖皮質激素用量變化,觀察并記錄相關不良事件。②無菌分離17例PNH患者BMMNCs,應用免疫磁珠技術將其分為CD59+細胞(GPI-AP陽性細胞)及CD59-細胞(GPI-AP陰性細胞)兩部分,用液體IMDM培養(yǎng)基加多種造血刺激因子模擬骨髓微環(huán)境來體外培養(yǎng),根據(jù)DAG體內濃度分別給予DAG方案和G
4、-CSF干預48小時,觀察這兩部分細胞體外生長情況,應用流式細胞術檢測兩組細胞死亡、凋亡、細胞周期相關指標,比較兩組細胞對DAG方案體外反應的差異。同時應用流式細胞術檢測G-CSF干預48小時后GPI-AP陽性和陰性骨髓細胞表面G-CSF受體(CD114)表達水平的差異。③收集14例PNH患者外周血,應用流式細胞術檢測GPI-AP陰性和陽性骨髓細胞表面黏附分子CD44/CD49d表達水平的差異,以探索PNH細胞克隆對DAG方案反應異常的
5、機制。④收集22例PNH患者和14名正常對照BMMNCs,并將其中14例PNH患者骨髓標本應用免疫磁珠技術分為GPI陰性細胞、陽性細胞兩部分,采用Q-PCR技術檢測CD114和CD44/CD49d mRNA表達水平。⑤無菌分離17例PNH患者BMMNCs,分別與患者自身血清、自身凍融后血清、與患者血型相同非PNH對照病例血清(同型血清組)及與患者血型相同非PNH對照病例凍融上清(同型凍融血清組)共同孵育1h和3h,同時設置PBS組為對照
6、組,流式細胞術檢測CD71+CD59-細胞比例變化。收集10例以上不同條件孵育1h后的各組細胞,應用Q-PCR技術檢測CD59mRNA的表達情況。所有的實驗數(shù)據(jù)均應用SPSS軟件和sigmaplot軟件統(tǒng)計并作圖。
結果:⑴DAG方案治療難治、復發(fā)性PNH的療效觀察。10例PNH患者化療后均有效:①血紅蛋白的改善:血紅蛋白水平從(58.1±12.12) g/L升至(90.20±21.55)g/L(P<0.001),10例患
7、者中4例患者(不需要輸血)血紅蛋白水平明顯提高,4例患者完全脫離輸血,其中1個達到正常血紅蛋白水平,1例病人輸血間期延長;②溶血指標變化:關于IBIL和TBIL,除1例患者始終正常外,其他9例例患者均下降:IBIL(36.8±29.2)U/L vs(18.1±12.4)U/L(P<0.05),TBIL(48.8±36.15)U/L vs(27.2±15.8)U/L(P=0.065);6例患者LDH降低(1656.12 vs1269.33
8、U/L;P=0.103);10例患者網(wǎng)織紅細胞降低(7.13±3.88)% vs(5.59±4.96)%(P=0.35);4例患者游離血紅蛋白濃度降低:72.50±61.31 vs32.50±22.17(P=0.134);1例患者Ham‘s test(+)vs Ham‘s test(-);③10例患者中,8例患者中粒細胞CD59-和CD55-的比例顯著降低,化療前后分別為(68.25±26.05)%和(81.47±26.13)% vs(
9、59.53±24.60)%和(68.14±26.53)%(P=0.007和P=0.003);④糖皮質激素逐漸減量,且沒有溶血發(fā)作,化療前后分別為(45.84±19.05)mg vs(13.00±6.75)mg(P<0.001);⑤安全性:血小板最低值為(1-60)×109/L,所有患者均未出現(xiàn)嚴重出血;白細胞和粒細胞的最低值分別為(0.2-4.68)×109/L和(0-1.8)×109/L。骨髓抑制期為10到23天,平均為19.76天。
10、出現(xiàn)的不良事件包括:戊肝1例、無效輸注1例、高熱無明確感染灶2例、上呼吸道感染3例、肺炎1例、敗血癥1例、口腔潰瘍1例,經過積極有效的抗感染及成分血輸注,均得以控制。⑵間接免疫磁珠技術能將PNH患者骨髓中GPI-AP陰性細胞分離純化,其純度可高達90%以上。PNH患者骨髓GPI-AP陰性和陽性細胞在體外培養(yǎng)中對DAG反應的差別:DAG方案體外干預GPI-AP陰性和陽性細胞48小時后,其死亡率和凋亡率變化:GPI-AP陰性細胞未加DAG干
11、預組(對照組)死亡率和凋亡率分別為19.10±20.93%和7.2±6.76%,DAG方案干預組死亡率為和凋亡率分別為27.29±22.04%和10.55±12.34%;而GPI-AP陽性細胞未加DAG干預組(對照組)死亡率和凋亡率分別為12.83±18.92%和凋亡率為9.66±7.96%,加DAG方案干預組死亡率和凋亡率分別為31.89±26.75%和凋亡率為6.31±1.32%;且與對照組相比,DAG方案干預組GPI-AP陽性死亡
12、率顯著增高(P<0.05),而GPI-AP陰性細胞死亡率亦增加,但無統(tǒng)計學意義,且GPI-AP陰性和陽性細胞凋亡率無顯著增加;DAG方案干預組GPI-AP陰性和陽性細胞死亡率均顯著大于凋亡率(P<0.05)。細胞周期的變化:與對照組相比較,DAG方案干預組GPI-AP陰性細胞和陽性細胞的細胞周期G0/G1及S期比例均無顯著性差異,DAG方案對兩者的細胞周期無明顯影響。G-CSF受體(CD114)的變化:與對照組相比較,G-CSF方案干預
13、組GPI-AP陰性和陽性細胞的CD114表達均增加,分別為41.76±44.62% vs26.79±41.62%和48.12±41.20% vs12.84±15.32%(P<0.05),前者不具有統(tǒng)計學差異。而GPI-AP陰性細胞和GPI-AP陽性相比較,GPI-AP陽性CD114表達的增加量更加顯著(33.97±36.03% vs14.88±27.02%)(P<0.05)。⑶CD44/CD49d蛋白的表達:GPI-AP陰性和陽性細胞C
14、D44的表達率分別為93.46±9.52%和97.66±4.21%,GPI-AP陽性細胞CD44表達更高,差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.05); GPI-AP陰性和陽性細胞CD49d的表達率分別為38.46±27.37%和43.79±24.77%,后者大于前者,但是尚不具有統(tǒng)計學差異。⑷Q-PCR檢測了22例PNH患者(對照組15例)及14例GPI-AP陰性和陽性細胞CD114mRNA的表達情況:與正常對照組相比較,PNH病例組為1.75
15、±1.90,對照組為2.57±2.18,兩者無統(tǒng)計學差異;而GPI-AP陰性和陽性細胞分別為1.69±2.34和2.78±2.52,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CD44mRNA的表達情況:PNH組與正常對照組相比較,CD44mRNA分別為1.73±2.20和3.80±3.87,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);同時14例GPI-AP陰性和陽性細胞的相比較,CD44mRNA分別為0.82±0.75和2.38±2.42(P<0.0
16、5);CD49d mRNA的表達情況:正常對照組和PNH病例組相比較,分別為2.83±2.62和2.56±3.04,差異無統(tǒng)計學意義;而14例GPI-AP陰性和陽性細胞的相比較,CD49dmRNA分別為1.74±2.60和1.94±3.02,兩者無統(tǒng)計學差異。⑸17例PNH患者BMMNCs,在不同條件下孵育后,CD71+CD59-細胞比例變化:①1h后:對照組、自身血清、自身凍融血清組、同型血清組及同型凍融血清組分別為75.08±27.
17、27%,72.80±26.97%,68.75±25.71%,68.35±29.19%,60.45±31.37%,與對照組相比較,自身凍融血清組及同型凍融血清組CD71+CD59-細胞比例均顯著降低(P<0.05;P<0.01);②3h后:各個組對應的CD71+CD59-細胞比例分別為73.84±27.63%、74.07±29.47%、65.51±29.15%、64.91±33.50%、60.05±27.79%,與對照組相比,自身凍融血清
18、組及同型凍融血清組CD71+CD59-細胞比例有下降趨勢,但無統(tǒng)計學意義。同時收集10例不同條件孵育1h后各組細胞,Q-PCR檢測CD59 mRNA的表達情況,結果為對照組、自身血清、自身凍融血清、同型血清組及同型凍融血清組CD59 mRNA的表達情況為分別為1.72±2.27、2.88±5.60、2.53±3.45、1.48±1.79和1.44±2.31,各組之間均無統(tǒng)計學差異。
結論:①DA聯(lián)合化療加G-CSF方案(D
19、AG)可以減少PNH克隆,使正常造血克隆有機會擴增,從而促進正常造血,同時還能控制溶血發(fā)作,減少皮質激素用量,且無嚴重不良事件發(fā)生,是目前較有希望和廣泛應用前景的治療手段。②DAG對PNH患者骨髓中GPI陰性克隆、陽性克隆的影響相似,而且均以導致兩者死亡的方式發(fā)揮作用,且對其細胞周期無顯著影響。③在體外,G-CSF能分別刺激骨髓中GPI陰性克隆、陽性克隆的CD114的表達,而且對GPI陽性克隆的刺激作用更明顯。此外,與GPI陽性相比,G
20、PI陰性細胞CD114 mRNA水平均顯著降低。這可能是G-CSF發(fā)揮作用的分子機制之一。④通過PNH患者與正常對照及GPI陰性克隆與GPI陽性克隆相比較,CD44蛋白水平及mRNA水平較低,差別具有顯著性。而CD49d的表達在GPI陰性克隆中較低,但無顯著性差異。粘附分子CD44的表達降低導致這部分細胞不能充分的利用骨髓微環(huán)境的“造血龕”而呈造血相對弱勢,這可能是體內外GPI陰性克隆造血功能差的另一機制。⑤與血型相同的外周血溶血上清孵
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