經(jīng)花生四烯酸氧化酶COX-2和12-LOX通路拮抗多發(fā)性骨髓瘤的效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：研究環(huán)氧化酶-2(cooxygenase-2，COX-2)在多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)中的表達(dá)及其抑制劑Meloxicam對MM細(xì)胞的作用。
　　 方法：采用多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226、KM3、U266為研究對象，以含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)各MM細(xì)胞系，分別以不同濃度的Meloxicam作用不同的時間后，應(yīng)用臺盼藍(lán)拒染法測定細(xì)胞活力變化，M

2、TT法檢測細(xì)胞的增殖變化；Annexin-V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)、TdT介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測細(xì)胞凋亡；熒光顯微鏡下觀察AO/EB染色后的細(xì)胞凋亡形態(tài)變化；RT-PCR及Western blot方法檢測COX-2的mRNA和蛋白水平表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)與對照組相比，10μM、25μM、50μM濃度的Meloxicam可明顯抑制RPMI8226、KM3的增殖(P<0.01)，并呈時間和劑量依賴，而對

3、U266細(xì)胞及正常人外周血單個核細(xì)胞的增殖無明顯影響；(2)Annexin-V/PI雙標(biāo)法流式細(xì)胞儀和TUNEL法檢測細(xì)胞的凋亡，Meloxicam作用后RPMI8226、KM3細(xì)胞凋亡百分率顯著增高(P<0.01)，AO/EB染色免疫熒光顯微鏡下可見典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；(3)Meloxicam能明顯抑制RPMI8226、KM3細(xì)胞COX-2 mRNA的表達(dá)以及包括U266細(xì)胞在內(nèi)的三種MM細(xì)胞COX-2蛋白的表達(dá)。
　　

4、 結(jié)論：MM細(xì)胞存在COX-2的表達(dá)；Meloxicam能有效抑制部分MM細(xì)胞系的增殖并促其凋亡，作用機(jī)制可能與COX-2通路的抑制有關(guān)。
　　 第二部分
　　 目的：研究體外COX-2小干擾RNA(COX-2 siRNA)對人MM細(xì)胞系RPMI8226增殖凋亡的作用及其與Bcl-2基因家族的關(guān)系，確證COX-2途徑在MM中的作用。
　　 方法：采用Nucleofector?技術(shù)將以COX-2基因exon 5為靶

5、標(biāo)的siRNA片段轉(zhuǎn)入RPMI8226細(xì)胞內(nèi)，分為轉(zhuǎn)染組RPMI8226細(xì)胞(RPMI8226siRNA)，未處理組RPMI8226細(xì)胞(RPMI8226Untreated)及空轉(zhuǎn)組RPMI8226細(xì)胞(RPMI8226Blank)；COX-2基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)水平采用RT-PCR和Western blot方法檢測；MTT法檢測細(xì)胞的增殖，Annexin-V/PI雙標(biāo)法流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡變化，其后又以TUNEL法進(jìn)一步證實(shí)凋亡變

6、化情況；Western blot方法檢測Bcl-2和Bax的變化。
　　 結(jié)果：(1)COX-2的小干擾RNA片段能通過Nucleofector?技術(shù)成功的轉(zhuǎn)入RPMI8226細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率大于78％；(2)RT-PCR和Western blot結(jié)果證實(shí)siRNA能顯著抑制RPMI8226細(xì)胞的COX-2 mRNA和蛋白水平的表達(dá)；(2)COX-2 siRNA能以時間依賴性方式抑制RPMI8226細(xì)胞的增殖，RPMI8226s

7、iRNA 細(xì)胞的OD值倍增時間為54.6小時，明顯長于RPMI8226Untreated細(xì)胞(30小時，P<0.001)和RPMI8226Blank細(xì)胞(32小時，P<0.001)。同時能顯著誘導(dǎo)其凋亡(0小時自發(fā)性凋亡率為6.52[％]±0.32[％]，12小時為12.53[％]±2.52[％]，24小時為24.39[％]±3.51[％]，48小時為36.48[％]±4.96[％])(P<0.01)；(3)COX-2 siRNA轉(zhuǎn)染后

8、，RPMI8226細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax的表達(dá)無明顯變化。
　　 結(jié)論：(1)COX-2小干擾RNA轉(zhuǎn)染能特異性抑制RPMI8226細(xì)胞中COX-2的表達(dá)，從而抑制RPMI8226細(xì)胞的生長并促其凋亡，不依賴于Bcl-2；(2)COX-2通路在MM細(xì)胞中起著重要作用。
　　 第三部分
　　 目的：研究12-脂氧合酶(12-loxygenase，12-LOX)在MM細(xì)胞RPMI8226中的表達(dá)

9、、對MM細(xì)胞增殖和凋亡的意義以及黃芩素對RPMI8226細(xì)胞的作用和機(jī)制。
　　 方法：采用多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226為研究對象，常規(guī)培養(yǎng)后分別以不同濃度(0μM、20μM、40μM、60μM)的黃芩素作用不同的時間(0h、24h、48h、72h)，應(yīng)用臺盼藍(lán)拒染法測定各時間點(diǎn)細(xì)胞活力變化，MTT法檢測細(xì)胞的增殖變化；Annexin-V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，Wright-Gimesa染色后觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)變化

10、；PI流式檢測細(xì)胞周期分布；RT-PCR及Western blot方法檢測mRNA和蛋白的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：(1)人多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞存在12-LOX的表達(dá)；(2)0μM、20μM、40μM、60μM濃度的黃芩素作用不同時間后，以時間和劑量依賴型方式抑制RPMI8226的增殖(P<0.01)，24小時IC50為80μM，48小時IC50為46μM，72小時IC50為30μM；12-LOX底物12-HETE能逆

11、轉(zhuǎn)40μM黃芩素對RPMI8226抑制增殖作用；(2)Annexin-V/PI雙標(biāo)法流式細(xì)胞儀和TUNEL法檢測細(xì)胞的凋亡，黃芩素作用后RPMI8226凋亡百分率顯著增高(P<0.01)，Wright-Gimesa染色后可見凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；(4)與對照組(71.5±12.1)％相比，20～60μM黃芩素分別導(dǎo)致(79.4±15.2)％～(83.4±15.6)％的細(xì)胞發(fā)生G0/G1期周期停滯，同時S期細(xì)胞比例明顯減少，為(21.5±5

12、.0)％～(5.9±2.2)％，并呈劑量依賴性變化，G2/M期細(xì)胞比例無明顯變化；(5)20～60μM的黃芩素處理RPMI8226細(xì)胞后，12-LOX蛋白水平呈濃度及時間依賴性降低(與對照組相比，P＞0.01)；黃芩素為60μM濃度時，幾乎完全抑制了12-LOX的表達(dá)；(6)20μM的黃芩素即能抑制MM細(xì)胞RPMI8226中Erk1/2的活化，并呈時間依賴性改變。
　　 結(jié)論：MM細(xì)胞存在12-LOX的表達(dá)并可能在MM細(xì)胞的增殖