同源異型盒基因與血管瘤發(fā)病機制的實驗研究.pdf

1、目的： 嬰幼兒血管瘤(簡稱血管瘤)是小兒最常見的良性腫瘤，其特點為生后早期出現(xiàn)并快速增長，隨后出現(xiàn)自發(fā)而緩慢的消退。雖然大多數(shù)血管瘤會自行消退，但部分病例中快速生長的瘤體可能損害重要臟器組織功能甚至危及生命，并影響外觀。對于這部分病例往往臨床處理困難，究其原因，是由于目前對血管瘤增殖和消退的病理發(fā)生機制不明確。 同源異型盒基因編碼一類轉錄因子的基因家族，其編碼的轉錄因子都包含一段長61個氨基酸被稱為同源結構域的DNA結合

2、序列，可以調控細胞的分化、增殖和遷移，在胚胎發(fā)育和器官形成以及成體腫瘤發(fā)生的過程中發(fā)揮重要調控作用。因此同源異型盒基因可能在生理和病理狀態(tài)下的血管形成過程中發(fā)揮重要的調控作用。最近的一些研究表明同源異型盒基因和導致血管成形術后再狹窄的血管細胞表型改變、血管生成和淋巴管生成有關。 因此，同源異型盒基因可能在血管瘤發(fā)病過程中也發(fā)揮了調節(jié)作用，其表達異?？赡苁窃斐裳芰霭l(fā)病的一個重要因素。本實驗擬采用基因芯片篩選和血管瘤發(fā)病相關的同源

3、異型盒基因，然后對他們在血管瘤組織中的表達規(guī)律進行研究，并觀察人為干預其表達的血管內皮細胞生物學性狀的變化，以了解這些基因的可能作用機制。 方法 (1)設立實驗組(血管瘤增殖期)與對照組(血管瘤消退期)各3例，均為在四川大學華西醫(yī)院進行手術的住院患者，診斷均經臨床及病理學診斷證實。術中取血管瘤瘤體組織，分為兩份，快速液氮保存，一份用于基因芯片研究，另一份用于HE染色。常規(guī)法抽提血管瘤組織總RNA，純化mRNA，用232種

4、人類同源異型盒基因Oligo探針制成基因芯片，將等量的兩組骨骼肌組織mRNA分別逆轉錄合成熒光標記的cDNA混合物探針，與上述基因芯片雜交，經嚴格洗片后，用掃描儀掃描芯片熒光信號圖像，計算機軟件數(shù)據(jù)處理，將所得的數(shù)據(jù)進行比較，得到二者間基因表達的差異信息。 (2)選取10例增殖期血管瘤、3例消退期血管瘤和11例血管畸形標本，均來至四川大學華西醫(yī)院和華西口腔醫(yī)院進行手術的住院患者，診斷均經臨床及病理證實。采用同樣的方法提取標本中的

5、RNA。采用實時定量PCR的方法檢測HOXC6在這些組織中的表達水平，并用比較閾值法進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學分析。 (3)設計、化學合成3條HOXC6特異性siRNA。體外培養(yǎng)人血管內皮細胞ECV304，以200nM siRNA用Oligo．fectamine<'TM>Reagent轉染細胞，應用實時定量PCR檢測轉染后48小時的細胞內HOXC6 mRNA表達，篩選出抑制效率最高的siRNA進行下一步實驗。選用抑制效率最高的siRN

6、A分別以50，100，150，200nM siRNA轉染人血管內皮細胞，應用MTT法檢測siRNA干擾后血管內皮細胞的增殖能力和細胞周期變化情況，并檢測細胞凋亡的情況。 結果 (1)通過基因芯片篩選，在232種同源異型盒基因中獲得與血管瘤可能相關的25條基因，其中在增殖期血管瘤組織中20條基因表達上調，5條基因表達下調。 (2)血管瘤增殖期HOXC6的表達明顯高于血管瘤消退期和血管畸形組織；而HOXC6在后兩者之

7、間的表達沒有明顯區(qū)別。 (3)化學合成的HOXC6特異性siRNA能夠抑制人血管內皮細胞ECV304內HOXC6表達，其沉默效應具有高效性。HOXC6 siRNA轉染ECV304細胞后72小時，細胞生長明顯受到抑制，細胞活力下降，并呈一定的濃度依賴性。細胞周期分析顯示HOXC6 siRNA將部分細胞阻滯在G<,1>／G<,o>期。Annexin V／PI檢測發(fā)現(xiàn)經HOXC6siRNA處理的ECV304組織細胞凋亡沒有明顯變化。