運用基因芯片技術研究復方丹參及其有效單體的內皮保護作用機理.pdf

1、研究背景與目的:該研究建立了以心血管疾病相關基因表達檢測寡核苷酸芯片為技術核心的研究平臺,并應用該芯片研究復方丹參的有效單體三七皂苷Rg1、丹參素和三七皂苷Re1對損傷內皮細胞基因表達譜的影響,從而進一步探討上述藥物的內皮保護作用的分子機理.同時對丹參素、三七皂苷Re1和復方丹參對oxLDL損傷的內皮細胞的影響基因進行聚類分析,為中藥復方的研究提供一個有益的探索.材料和方法:(1)第一部分:檢索Cardio數據庫,獲得五百余個心血管疾病

2、相關基因;從Genebank中獲得這些基因的mRNA序列;運用Mprobe設計檢測用寡核苷酸探針;在線BLAST同源分析,獲得特異性最佳的寡核苷酸探針序列;設計陽性對照、陰性對照和看家基因的探針作為芯片的質控點;合成探針、點樣制備芯片;提取培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的總RNA;將完全相同的總RNA分別反轉錄成Cy3或Cy5標記的cDNA熒光探針;芯片雜交,對芯片進行檢測的靈敏度、特異性、重復性和真實性進行分析.(2)第二部分:用

3、致炎因子TNF-α刺激HUVEC,檢測HUVEC釋放NO的量,從而建立內皮功能失常的體外模型;篩選三七皂苷Rg1保護內皮細胞的有效作用濃度;運用制備的芯片研究三七皂苷Rg1對TNF-α刺激的內皮細胞基因表達譜的影響;用RT-PCR和Westernblot方法對芯片篩選出的差異基因中的一個基因-eNOS進行驗證.(3)第三部分:用oxLDL作用于HUVEC,檢測細胞內的脂質過氧化產物-MDA的含量,從而建立內皮細胞氧化損傷的體外模型;篩選