檢測動物皮毛中6種致病菌的基因芯片技術研究.pdf

1、本研究根據WHO、OIE等權威機構公布的各國疾病流行情況和相關的文獻資料，結合實驗室病原分離、鑒定結果，以動物皮毛中常見的6種致病菌布氏桿菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、丹毒桿菌、銅綠假單胞桿菌等為研究對象，選擇16srDNA基因和gyrB基因進行序列分析，設計兩對通用引物和相應的多條細菌鑒別探針，研究同時檢測6種致病菌的基因芯片檢測方法，并進行實際應用效果評價。主要研究內容和結果如下:
　　1.在對動物皮

2、毛攜帶布氏桿菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、丹毒桿菌、銅綠假單胞桿菌等鑒定的基礎上，采用CTAB法，酚氯仿法、Na(I)法和NaOH-SDS法分別提取6種致病菌的核酸，比較提取核酸含量、純度和完整性，發(fā)現:酚氯仿法可作為基因芯片檢測的通用核酸提取方法。
　　2.選擇在細菌生物學上具有重要意義的16s rDNA基因和gyrB基因，對6種致病菌的序列分析后分別設計2對通用引物和對應的1～5條特異性寡核苷酸探針，

3、每條上游引物標記TAMARA熒光基團。使用芯片點樣液將各個探針稀釋為30μmol/L，點樣制備檢測基因芯片，每個矩陣為18×10陣列（行×列），每條探針5個重復點。建立每種細菌基于16s rDNA基因和gyrB基因的通用不對稱的PCR方法，其產物與制備基因芯片雜交，優(yōu)化并建立同時檢測6種致病菌的基因芯片方法。結果表明:基因芯片最佳反應條件為使用47％甲酰胺雜交液，42℃雜交4h。該芯片的檢測方法特異性好，僅與布氏桿菌、大腸桿菌O157、