肝癌胚胎抗原的篩選及鑒定.pdf

1、目的肝細胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)為廣西高發(fā)腫瘤，是死亡率最高的惡性腫瘤之一。通過SEREX技術，用人肝癌血清從人體胚胎干細胞cDNA表達文庫中篩選肝癌相關抗原，并對SEREX條件方法作進一步的改良；對篩選出的抗原進行分子鑒定并對其中的抗原進行細胞和組織學分析。 方法:頂層培養(yǎng)基Top-agar作梯度濃度和梯度體積實驗，確定在最佳濃度和體積情況下Top-agar粘附在NC膜上最少；用膜吸收和親

2、和偶聯層析兩種方法分別對血清進行預處理，確定能最多消除假陽性的血清預處理方法。預處理38例原發(fā)性肝癌病人血清，結合SEREX技術，應用Westernblot方法，對表達文庫中的相關抗原做血清學免疫篩選。對第一輪篩選的肝癌相關抗原再進行復篩。陽性克隆體內刪除，雙酶切鑒定后，進行測序及生物信息學分析。對篩選出的肝癌抗原之一Cap2做肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌細胞株及正常肝細胞株RT-PCR鑒定，同時使用組織芯片做原位RT-PCR鑒定其組織表達

3、譜。 結果:經探索，在直徑為150mm培養(yǎng)皿中最適揭膜條件為0.83％濃度的Top-agar15ml培養(yǎng)噬菌體后在4℃放置20分鐘揭膜。親和偶聯預處理血清的效果好于膜吸收的效果。在SEREX初篩選中，我們得到了176例陽性噬菌體克隆，對單克隆分別進行假陽性排除，最終得31例噬菌體陽性克隆。體內刪除法獲得相應的質粒。質粒T3、T7引物測序發(fā)現1例無信號出現。30例抗原中23例為已知蛋白質，7例與已知蛋白質同源性相差較大，為未知蛋白

4、質。針對其中的肝癌相關抗原Cap2(144號calponin2)做進一步鑒定發(fā)現，其在肝癌、胃癌、肺癌等細胞株中有強表達，在乳腺癌細胞株中有弱表達而在正常肝細胞株中未見表達。同時進行組織芯片insituRT-PCR鑒定，在167例肝癌組織中89例顯陽性，50例正常組織4例出現陽性，在肝癌和正常肝組織中表達有差異(p<0.05)。 結論:首次在人體胚胎干細胞cDNA表達文庫中篩選肝癌抗原。從人胚胎干細胞與肝癌細胞的共性著手，依據它