骨髓間充質干細胞移植在腦復蘇治療中應用的實驗研究.pdf

1、心搏驟停(CA)導致極高的致死、致殘率，已成為威脅人類健康的重要因素。近年來隨著急救網(wǎng)絡完善，急救技術進步，心搏驟停患者恢復自主循環(huán)的機會增加，但絕大多數(shù)自主循環(huán)恢復(ROSC)的患者卻隨后因腦功能損害而死亡或殘留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。如何有效地實施腦復蘇治療挽救缺血神經(jīng)元，促進受損神經(jīng)組織修復以盡可能維持正常的神經(jīng)功能已成為心肺復蘇的重點，也是目前急救醫(yī)學面臨的難題。長期以來，腦復蘇藥物治療的研究進展不大，低溫治療雖具有一定的腦保護作用，但

2、難以逆轉已形成的神經(jīng)損害，因而有待新的治療措施出現(xiàn)以提高腦復蘇的治療效率。
　　 干細胞移植是近幾年興起的治療手段，在此前腦梗塞的實驗研究中，以骨髓間充質干細胞(MSCs)為主的干細胞治療取得了令人矚目的進展，研究表明MSCs移植后減輕了局灶性缺血導致的神經(jīng)元損傷，減少了梗死面積，并促進了神經(jīng)功能恢復，提示MSCs移植可能在腦復蘇治療中具有一定的應用前景。目前尚未有干細胞移植應用于腦復蘇治療的研究報道，而全腦缺血損害發(fā)病機制、缺

3、血損傷范圍、性質都有別于局灶性腦梗死，因此MSCs移植后如何在腦組織內分布和分化，是否能減輕全腦缺血損傷尚不得而知。
　　 本研究探討MSCs移植對心搏驟停后全腦缺血損傷的治療作用以探索新的腦復蘇治療途徑。主要內容包括:建立大鼠MSCs培養(yǎng)和擴增方法，體外驗證MSCs向神經(jīng)元樣細胞分化的能力；建立大鼠腦復蘇模型；增強型綠色熒光蛋白(EGFP)標記MSCs，觀察EGFP-MSCs移植對全腦缺血損傷的治療作用以及移植細胞在腦內分布和

4、分化情況；進一步利用磁共振成像(MRI)技術活體示蹤移植的MSCs。
　　 第一部分大鼠骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)及向神經(jīng)元樣細胞分化的研究
　　 研究目的:建立大鼠骨髓MSCs的體外培養(yǎng)方法，研究MSCs的生物學特性。驗證MSCs在體外向神經(jīng)元樣細胞分化的能力。為MSCs移植在腦復蘇治療中應用的研究提供實驗和理論基礎。
　　 材料和方法:細胞培養(yǎng)健康4～5周齡Sprague-Dawley(SD)大鼠，無菌條件下抽

5、取骨髓，用貼壁培養(yǎng)法分離骨髓MSCs，在37℃、50％CO2、飽和濕度的條件下，以含有10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，24h半量換液，3d全量換液。7～9天細胞鋪滿瓶底后第一次傳代，此后在細胞生長至約90％融合時進行傳代。
　　 MSCs生物學特性培養(yǎng)過程中觀察細胞形態(tài)，以MTT法測定細胞生長曲線，流式細胞儀檢測細胞周期和細胞表面抗原CD45、CD11b、CD29、CD44表達情況。
　　 誘導MSCs向神經(jīng)

6、元樣細胞分化以丹參和β-巰基乙醇(β-ME)進行誘導，選擇生長狀態(tài)良好的第3代的MSCs，按2x105/孔密度接種6孔板，加入丹參和β-ME預誘導液培育24h，更換培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，分別加入丹參和β-ME誘導液誘導5h。觀察誘導后細胞形態(tài)變化，采用RT-PCR和免疫熒光技術檢測星形膠質細胞酸性蛋白(GFAP)和微管相關蛋白-2(MAP-2)的mRNA和蛋白表達情況。
　　 結論:
　　 1.建立了MSCs原代培養(yǎng)和

7、體外擴增的實驗方法；
　　 2.MSCs取材方便，增殖活性高，體外培養(yǎng)易于擴增、純化，符合干細胞移植研究的需要；
　　 3.β-巰基乙醇和丹參等誘導劑可在體外誘導MSCs分化為神經(jīng)元樣細胞。
　　 第二部分大鼠心搏驟停和復蘇裝置研發(fā)和腦復蘇模型的建立
　　 研究目的:研發(fā)大鼠心搏驟停和復蘇裝置(包括電刺激致顫器和機械復蘇裝置)，掌握利用該裝置建立標準復蘇模型的技術參數(shù)和實驗條件；研究建立腦復蘇模型的合適缺

8、血時間；探討MR檢測在評價全腦缺血損傷中的應用價值。
　　 材料和方法:心搏驟停和復蘇裝置研發(fā)和復蘇模型研究研發(fā)用于大鼠交流電致顫器和機械復蘇裝置。選用SD雄性大鼠20只，應用研發(fā)的心搏驟停和復蘇機械裝置，持續(xù)交流電經(jīng)右心室內膜致顫。在6min心室顫動后，開始給予6min的機械胸外按壓和同步機械通氣，隨后雙向波經(jīng)胸體外除顫。
　　 腦復蘇模型合適缺血時間的研究實驗分組:(1)對照組，進行手術操作，不致顫和復蘇；(2)VF

9、6組，無處理室顫6min，復蘇6min；(3)VF8組，無處理室顫8min，復蘇6min；(3)VF10組，無處理室顫10min，復蘇6min；實驗組大鼠在ROSC后1d、3d、7d、14d分別進行腦組織病理以及含水量檢測和NSS神經(jīng)功能評分。對照組在手術完成后24h進行上述檢測和評分。
　　 MR評價全腦缺血損傷的研究實驗組于ROSC后上述時間點再次麻醉動物進行MR檢測。對照組3只大鼠在完成手術操作后3d進行MR檢測。MR檢測

10、序列包括SET1WI、T2WI，T1WI:TR350ms，TE18ms，T2WI:TR1600ms，TE80ms，矩陣256×256，層厚2mm，視野7cm×7cm，線圈11cm。
　　 結論:
　　 1.研制成功大鼠交流電致顫器和機械心肺復蘇裝置。該裝置符合心肺腦復蘇實
　　 驗研究的要求；
　　 2.CPP維持在25mmHg左右是復蘇成功的條件；
　　 3.未處理室顫8min和心肺復蘇6min

11、是較為合適的腦復蘇模型缺血時間；
　　 4.心搏驟停后全腦缺血損傷具有部位選擇性和延后性特點；
　　 5.MR檢查可以應用于評價全腦缺血損傷。
　　 第三部分MsCs移植應用于腦復蘇治療的研究
　　 研究目的:研究通過腺病毒載體(Ad5F35)轉導外源基因增強型綠色熒光蛋白(EGFP)體外標記MSCs的有效性和安全性；以大鼠腦復蘇模型為研究對象，通過頸動脈移植EGFP-MSCs，觀察EGFP-MSCs是否

12、進入全腦缺血損傷腦組織，能否分化為神經(jīng)細胞；通過病理組織檢測、腦組織含水量測定和神經(jīng)功能評分評價MSCs移植對全腦缺血損傷的治療作用。
　　 材料和方法:EGFP體外標記MSCs通過腺病毒載體Ad5F35將EGFP基因轉染MSCs，以流式細胞儀和熒光顯微鏡觀察評價不同條件下的轉染率；觀察轉染后EGFP-MSCs的細胞活力、凋亡率、細胞周期以及向神經(jīng)元樣細胞分化能力。
　　 MSCs移植治療全腦缺血損傷的研究(1)分組設計

13、:按前述方法建立大鼠腦復蘇模型，大鼠經(jīng)歷8分鐘無處理室顫和6分鐘心肺復蘇，ROSC后進行右頸動脈置管，將大鼠隨機分為兩組:PBS組和:EGFP-MSCs組，分別于ROSC后2h由右頸動脈輸入5×106EGFP-MSCs或0.5mlPBS每組納入實驗動物數(shù)為24只。(2)治療作用評價:在大鼠自主循環(huán)恢復后1d、3d、7d、14d以NSS評分評價大鼠神經(jīng)功能，并進行腦組織病理和含水量檢測。
　　 MSCs移植后在腦組織分布和分化情況

14、制備腦組織冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察熒光細胞分布情況，同時采用免疫熒光檢測MAP-2、GFAP表達情況。
　　 結論:
　　 1.通過腺病毒載體Ad5F35轉染EGFP，可以高效、穩(wěn)定、安全地標記MSCs；
　　 2.MSCs移植可進入全腦缺血損傷腦組織內，并部分分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞；
　　 3.MSCs移植可減輕全腦缺血腦組織損傷，改善神經(jīng)功能，促進腦組織水腫消退。
　　 第四部分MSCs

15、菲立磁標記及MR活體示蹤的研究
　　 研究目的:研究通過硫酸魚精蛋白為載體將菲立磁轉入MSCs，對MSCs進行磁性標記的可行性和安全性；在腦復蘇模型中探討以MR活體示蹤移植的磁性標記MSCs的可行性；以MR活體示蹤技術研究MSCs移植后在全腦缺血損傷腦內分布和遷移規(guī)律。
　　 材料和方法:菲立磁標記 MSCs的體外實驗(1)以硫酸魚精蛋白為載體將10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL不同劑量菲立

16、磁轉入MSCs，以電鏡檢查和普魯士藍染色進行標記后鑒定和標記率分析；(2)對磁性標記后的MSCs作MR體外成像研究；(3)觀察磁性標記對MSCs細胞形態(tài)、增殖活性、凋亡率影響。
　　 磁標記MSCs移植后MR活體示蹤的研究(1)分組設計:假手術組(n=3)在手術操作完成后不進行心搏驟停和心肺復蘇，手術操作完成后4h經(jīng)右頸動脈輸入5×106磁性(FE-PRO)標記MSCs；大鼠.ROSC后隨機分為兩組:FE-PRO標記MSCs組和

17、單純MSCs組，分別在大鼠ROSC后2h經(jīng)右頸動脈輸入5×106魚精蛋白-菲立磁(FE-PRO)標記MSCs或未標記MSCs。(2):MR檢測:在輸入細胞后1d、3d、7d、14d再次麻醉大鼠進行MR檢測，各時間點各3只動物。檢測部位包括腦、肝臟、脾臟、股骨骨髓腔，檢測序列均為SET1WI，SET2WI。(3)組織普魯士藍染色在各時間點進行完MR檢測后，取腦、肝臟、脾臟、肺臟多聚甲醛固定，石臘包埋，切片，普魯士藍染色30min，隨后核固