診斷超聲對HEK-293細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的：探討診斷超聲照射對體外培養(yǎng)的HEK-293 細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制，以進(jìn)一步明確超聲照射對胚胎細(xì)胞的影響作用，比較照射劑量的不同所產(chǎn)生的不同的生物學(xué)效應(yīng)。 方法：采用HEK-293細(xì)胞，應(yīng)用傳代培養(yǎng)技術(shù)，完成HEK-293細(xì)胞的體外培養(yǎng)。進(jìn)行超聲劑量分組，建構(gòu)照射模型。主要分成四個(gè)劑量梯度(分別為0min、10min、20min、30min，均為產(chǎn)科條件)，每個(gè)劑量梯度設(shè)三個(gè)平行瓶，重復(fù)三次。對處理后的細(xì)胞進(jìn)行Hoechs

2、t33258凋亡染色，觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化；對其進(jìn)行PI染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布；對處理后的細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡染色，流式細(xì)胞儀檢測并行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)。處理后的細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR對Caspase-3凋亡關(guān)鍵酶的RNA水平進(jìn)行測定；活化的Caspase-3蛋白表達(dá)水平進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)的檢測。 結(jié)果：HEK-293 細(xì)胞體外培養(yǎng)成功，細(xì)胞狀態(tài)良好，貼壁生長。Hoechst33258染色顯示空白

3、組細(xì)胞經(jīng)超聲假照后，細(xì)胞核大小較一致，核膜完整，未見異形核，超聲處理10min組的細(xì)胞，對比空白組部分細(xì)胞核形態(tài)出現(xiàn)大小不一的現(xiàn)象，但細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)異常，超聲處理20min組，細(xì)胞核大小不均，一部分細(xì)胞核脹大，染色質(zhì)邊集，一部分細(xì)胞核縮小濃染，超聲處理30min組，細(xì)胞形態(tài)變化最大，可見異形核的出現(xiàn)，部分核內(nèi)染色質(zhì)濃染邊集成小團(tuán)塊狀，個(gè)別核膜破裂染色質(zhì)疏松分布于胞質(zhì)中；隨著超聲照射劑量的加大可以使HEK-293 細(xì)胞的周期發(fā)生改變，

4、超聲處理20min組S期增加(P<0.05)，30min組G0/G1期增加(P<0.05)，其中G2/M期減少、S 期增加有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Annexin V-FITC/PI 雙染色顯示，隨著超聲照射劑量的增加，流式計(jì)數(shù)的細(xì)胞凋亡率增加，20min組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，30min組具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；超聲照射對凋亡關(guān)鍵蛋白酶Caspase-3 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平未見明顯影響，對其蛋白表達(dá)水

5、平可見影響，超聲照射20min 后，胞漿里逐漸出現(xiàn)了凋亡蛋白酶 Caspase-3的表達(dá)，并隨著照射劑量的增加，Caspase-3的表達(dá)水平增加。 結(jié)論：大劑量的超聲照射可對體外培養(yǎng)的 HEK-293 細(xì)胞產(chǎn)生凋亡及相關(guān)的影響。隨著超聲照射的時(shí)間達(dá)到或超過 20min，部分細(xì)胞會逐步出現(xiàn)核形態(tài)的改變，如染色質(zhì)邊集，異形核的出現(xiàn)，甚至核膜破裂；可使細(xì)胞周期分布改變，G0/G1期和S期阻滯，進(jìn)入 G2/M 期的細(xì)胞減少；可使細(xì)胞凋亡