MIPU1對(duì)阿霉素所致HEK293細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用.pdf

1、目的:阿霉素(Doxorubicin，DOX)是臨床上用于治療腫瘤的化療藥物，但是阿霉素存在很大的毒副作用，如阿霉素心肌病，阿霉素腎病等。這些毒副作用主要和細(xì)胞凋亡有關(guān)。Mipu1是本科室發(fā)現(xiàn)的一個(gè)缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的新基因(GenBank登錄號(hào)為AY221750)，并已證實(shí)Mipu1是一種KRAB型鋅指蛋白，具有轉(zhuǎn)錄抑制作用。通過(guò)生物信息學(xué)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)Mipu1結(jié)構(gòu)上十分保守，在嚙類動(dòng)物和人之間具有相當(dāng)高的同源性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)基

2、因Bax、Bcl-2、P53、Bid、Bak等的啟動(dòng)子區(qū)含有Mipu1的核心結(jié)合位點(diǎn)。然而，Mipu1是否可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)上述凋亡相關(guān)基因表達(dá)，從而減輕DOX的細(xì)胞毒性作用并不清楚。因此，本研究擬在探討MIPU1對(duì)DOX所致細(xì)胞凋亡的影響及其可能的分子機(jī)制，以期為深入闡明新基因Mipu1的生物學(xué)功能提供新的證據(jù)，為預(yù)防DOX抗腫瘤治療過(guò)程中的毒副作用提供新的思路。
　　方法:本次實(shí)驗(yàn)以DOX誘導(dǎo)人胚胎腎細(xì)胞（HEK293）凋亡為

3、模型[1]，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MIPU1真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-MIPU1，使細(xì)胞過(guò)表達(dá)MIPU1。實(shí)驗(yàn)分為四組，即pEGFP組、MIPU1組、pEGFP+DOX組和MIPU1+DOX組。(1)采用MTT實(shí)驗(yàn)觀察DOX處理下MIPU1過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞存活率的影響;(2)采用Hoechst33258染色、Caspase-3活性檢測(cè)和流式細(xì)胞術(shù)分析MIPU1過(guò)表達(dá)對(duì)DOX所致細(xì)胞凋亡的影響;(3)采用Western blot和RT-PCR分析MIPU

4、1過(guò)表達(dá)對(duì)DOX所致抗凋亡基因Bcl-2、促凋亡基因P53和Bax在蛋白和mRNA水平表達(dá)變化的影響;(5)采用雙熒光素酶報(bào)告基因分析MIPU1對(duì)Bax啟動(dòng)子活性的影響。
　　結(jié)果:(1) HEK293細(xì)胞經(jīng)過(guò)DOX處理后細(xì)胞存活率明顯下降(p＜0.01 VS pEGFP);當(dāng)轉(zhuǎn)染pEGFP-MIPU1使細(xì)胞過(guò)表達(dá)MIPU1后，DOX所致的細(xì)胞死亡被明顯抑制(P＜0.05 VS pEGFP+DOX)。(2)HEK293細(xì)胞經(jīng)過(guò)DO

5、X處理后細(xì)胞凋亡率明顯增加(P＜0.01 VSpEGFP);過(guò)表達(dá)MIPU1則明顯抑制DOX所致的細(xì)胞凋亡率的增加(P＜0.01 VS pEGFP+DOX)。(3) DOX處理HEK293細(xì)胞后，Bcl-2的表達(dá)明顯減少(P＜0.05 VS pEGFP);但是過(guò)表達(dá)MIPU1后Bcl-2的表達(dá)則明顯增多(P＜0.05 VS pEGFP+DOX)。(4) HEK293細(xì)胞經(jīng)過(guò)DOX處理后，Bax和P53的表達(dá)明顯增多(P＜0.05 VSp

6、EGFP);過(guò)表達(dá)MIPU1后，Bax和P53的表達(dá)則明顯下降(P＜0.05VS pEGFP+DOX)。(5)將含有Bax啟動(dòng)子的報(bào)告基因與pEGFP-MIPU1共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)熒光素酶活性明顯下降，且兩者呈量效關(guān)系，當(dāng)Bax啟動(dòng)子發(fā)生突變后，則熒光素酶活性不受影響(P＜0.01 VS pEGFP)。
　　結(jié)論:(1) MIPU1過(guò)表達(dá)對(duì)DOX引起的HEK293細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用;(2)其機(jī)制可能與抑制DOX導(dǎo)致的Bcl-2