調(diào)節(jié)Ref-1的表達對HEK293細胞抗氧化應激功能的影響.pdf

1、氧化應激(oxidativestress)是指由于氧自由基過量生成和/或細胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受損，導致氧自由基及其相關(guān)代謝產(chǎn)物過量聚集，從而對細胞產(chǎn)生多種毒性作用的病理狀態(tài)，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。氧化還原因子-1(Redoxeffectfactor-1)又稱作脫嘌呤/脫嘧啶內(nèi)切核酸酶(apurinic/apyrimidinicendonuclease)，是細胞內(nèi)廣泛存在的一種多功能蛋白。它在細胞堿基修復途徑中作用于脫嘌呤/脫嘧啶位點

2、，主要參與由于氧化性損傷造成的DNA損害的修復；同時，Ref-1也是一種氧化還原作用因子，影響多種核轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性，通過對核轉(zhuǎn)錄因子的氧化還原修飾來調(diào)節(jié)細胞基因的表達。此外，Ref-1在細胞凋亡、細胞周期調(diào)控、腫瘤生理及細胞氧化應激中都發(fā)揮重要的作用。 近年來，有關(guān)Ref-1在抗氧化性損傷作用機制的研究逐步深入。多種應激誘導Ref-1表達增加可抑制細胞凋亡的發(fā)生，但其機制尚不明確。本課題通過改變Ref-1蛋白在HEK2

3、93細胞中的表達，觀察其對細胞抗氧化性損傷的功能影響，并探討可能的機制，為進一步研究Ref-1抗氧化性損傷的機制提供新的思路和理論基礎(chǔ)。 主要研究方法和結(jié)果： 1.構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLEGFP-N1介導的Ref-1高表達載體。利用RT-PCR方法從Hela細胞中克隆人的全長Ref-1cDNA片段，將其插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLEGFP-N1的多克隆位點，Ref-1與質(zhì)粒載體上EGFP片段之間以內(nèi)部核糖體進入位點(inter

4、nalribosomeentrysite，IRES)相連，構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導的Ref-1高表達載體。測序及酶切結(jié)果表明，從Hela細胞中成功擴增人的全長Ref-1cDNA片段，載體構(gòu)建正確。 2.構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體Pmscv/hyg介導的Ref-1RNA干擾載體。PCR擴增人U6啟動子序列和EGFP序列，分別插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體Pmscv/hyg。在Ref-1的mRNA鏈上分別選定4個不同位點作為干擾的目標序列，化學合成寡核苷

5、酸，在U6啟動子的下游插入干擾序列獲得shRNA-Ref-1表達體。測序及酶切結(jié)果表明重組載體構(gòu)建成功。 3.病毒感染HEK293細胞。重組質(zhì)粒PLEGFP-N1-Ref-1和Pmscv-Ref-1-siRNA及相關(guān)對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染病毒包裝細胞PT-67，24小時后收集上清感染靶細胞。抗生素G418和Hygromycin分別篩選陽性細胞14天。RT-PCR及westernblot檢測Ref-1mRNA及蛋白表達。 4.調(diào)

6、節(jié)Ref-1表達對細胞抗氧化損傷的影響。200μM、400μM、600μMH2O2分別刺激Ref-1高表達及對照組細胞30min，12小時后MTT實驗及流式細胞儀檢測各組細胞間死亡率無顯著性差異(P>0.05)。亞致死量(200μM)H2O2刺激Ref-1低表達及對照組細胞30min，12小時后收集細胞，流式細胞儀術(shù)、MTT實驗及Hoechest33258染色法證實沉默Ref-1增加細胞對氧化刺激的敏感性：細胞死亡率升高，活力下降(P<

7、0.05)。同時，下調(diào)Ref-1減弱細胞內(nèi)ROS清除能力。 5.Westernblot檢測Bcl-2、Bax、caspase-3和cytochromec。下調(diào)Ref-1的表達增加細胞對H2O2誘導凋亡的敏感性，Westernblot檢測在此過程中Bcl-2上調(diào)受到抑制，而Bax升高，caspase-3被激活，cytochromec從線粒體中釋放。 結(jié)論及研究意義:1.構(gòu)建了高效抑制蛋白表達的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體2.高表達Ref

8、-1不能提高細胞對氧化性損傷的抵抗3.抑制Ref-1的表達增加細胞對氧化性損傷的敏感性，Bcl-2上調(diào)受到抑制，Bax表達升高，caspase-3被激活，cytochromec釋放。 本研究證實抑制Ref-1的表達引起細胞對氧化性損傷敏感性增加，同時Bcl-2上調(diào)受到抑制，Bax表達升高，caspase-3被激活，cytochromec釋放，是一種典型線粒體介導的凋亡通路。由此，我們推測Ref-1在氧化應激中與Bcl-2家族蛋白