AG03蛋白對HEK293細(xì)胞周期的影響及其蛋白復(fù)合物的細(xì)胞定位.pdf

1、最初，研究人員在植物中發(fā)現(xiàn)Argonaute（AGO）蛋白是發(fā)育調(diào)節(jié)因子，后來進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)它們是RNA沉默中的核心分子、它與小的非編碼RNAs（siRNA，miRNA，piRNA）生物發(fā)生和細(xì)胞功能密切相關(guān)，它可以結(jié)合小RNAs，調(diào)控蛋白質(zhì)的合成或影響mRNA的穩(wěn)定性，即RNA干擾（RNAi）技術(shù)。Argonaute（AGO）：是一個高度保守的家族，這一蛋白家族包括許多成員，同時，不同的AGO蛋白有著不同的生物學(xué)功能。由于在人體細(xì)胞內(nèi)敲除

2、ago3后不能降解目標(biāo)mRNA、抑制蛋白表達(dá)，另外轉(zhuǎn)入的ago3基因在人體細(xì)胞中很難穩(wěn)定表達(dá)，所以對人體Ago3的功能還不清楚。本實驗通過RNA干擾技術(shù)和轉(zhuǎn)染外源ago3表達(dá)質(zhì)粒的方法調(diào)控人體細(xì)胞中Ago3的下調(diào)和上調(diào)，從而研究、探討Ago3蛋白的功能。本文首先介紹了RNAi干擾技術(shù)，接著又詳細(xì)介紹了Argonaute蛋白家族及其功能。
　　 利用不同的轉(zhuǎn)染方法將具有熒光標(biāo)記的si-ago3、 c-flag-ago3質(zhì)粒轉(zhuǎn)入MC

3、F7、Hela、HEK293細(xì)胞中；培養(yǎng)24h后，倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，選擇最佳轉(zhuǎn)染條件；RT-PCR檢測si-ago3、flag-ago3介導(dǎo)的細(xì)胞中ago3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化；蛋白印跡法（Western blotting）法檢測外源導(dǎo)入的flag-ago3質(zhì)粒能否在HEK293細(xì)胞中成功表達(dá)；MTT法繪制質(zhì)粒si-ago3轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞24h、48h、72h的生長曲線；流式細(xì)胞儀進(jìn)一步測定si-ago3和c-fla

4、g-ago3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48后，Ago3蛋白不同表達(dá)水平對HEK293細(xì)胞周期產(chǎn)生的影響；免疫熒光法定位Ago3蛋白。
　　 經(jīng)過Western blotting驗證，表明采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法可以使外源ago3基因在HEK293細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，通過RNAi干擾技術(shù)下調(diào)Ago3可以抑制HEK293細(xì)胞的正常生長，使G0/G1期受阻滯，而過度表達(dá)Ago3會加快細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，說明一定量的Ago3蛋白是HEK293細(xì)胞正常生長所必不可

5、少的，其過多或過少表達(dá)都會影響細(xì)胞G1/S期的進(jìn)程對生長造成影響。RT-PCR，檢測在細(xì)胞周期中調(diào)控G1/S轉(zhuǎn)換過程的cyclin D1、p161NK4a基因在Ago3缺失、過量表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞周期變化過程中的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示Ago3蛋白不同的表達(dá)水平直接影響了細(xì)胞周期蛋白cyclinD1的生物合成，間接的調(diào)控了細(xì)胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)化進(jìn)程，從而影響細(xì)胞的增殖。而P16基因在細(xì)胞周期變化過程中并沒有明顯的改變，因此還有待于進(jìn)一步研究。最后