鞣花酸對HEK-293細(xì)胞的DNA損傷毒性作用以及可能的氧化應(yīng)激、溶酶體膜通透機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 鞣花酸(Ellagicacid，EA)，是廣泛存在于各種具有軟果或堅(jiān)果的植物組織中的一種天然多酚成分。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，EA具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞增殖、抗菌和抗病毒等生物學(xué)作用，同時(shí)已有研究報(bào)道EA具有DNA損傷活性。本研究通過觀察EA致HEK-293細(xì)胞DNA損傷，探討EA對DNA損傷可能的毒性機(jī)制（氧化應(yīng)激和溶酶體膜通透），為評(píng)估EA對人類的健康影響提供試驗(yàn)及理論依據(jù)。
　　 方法:
　

2、　 以HEK-293細(xì)胞作為試驗(yàn)系統(tǒng)。通過單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)檢測EA引起體外HEK-293細(xì)胞的DNA損傷，評(píng)價(jià)EA的DNA損傷毒性。為探討其可能的DNA損傷機(jī)制，以2'，7'—二氫二氯熒光素(DCFH)和苯二醛(OPT)分別測定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)以及還原性谷胱甘肽(GSH)水平，以免疫組化方法檢測細(xì)胞內(nèi)8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的表達(dá)水平，以吖啶橙(AO)和羅丹明123(Rhodamine123)分別測定細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜穩(wěn)定

3、性和線粒體膜電位的改變水平，通過N-乙酰半胱氨酸(NAC)干預(yù)試驗(yàn)觀察氧化性損傷對DNA損傷的影響，通過氯化銨(NH4Cl)干預(yù)試驗(yàn)觀察溶酶體膜穩(wěn)定性對DNA損傷的影響，通過地昔帕明（desipramine，酸性神經(jīng)鞘磷脂酶的抑制劑）和抑胃肽（pepstainA，組織蛋白酶D的抑制劑）干預(yù)試驗(yàn)觀察溶酶體內(nèi)酸性水解酶對DNA損傷的影響。試驗(yàn)結(jié)果用SPSSvl1.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果:
　　 EA(120μM

4、)作用于HEK-293細(xì)胞1小時(shí)后，引起DNA鏈斷裂，細(xì)胞成彗星樣拖尾，與DMSO空白對照組比其尾長明顯增長，尾DNA％增大;同時(shí)，EA（60μM-120μM）作用于HEK-293細(xì)胞3h后，可致細(xì)胞內(nèi)8-OHdG的表達(dá)水平升高;EA(120μM)作用于HEK-293細(xì)胞1小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加、GSH水平下降;EA（30μM-120μM）作用于HEK-293細(xì)胞1小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜穩(wěn)定性下降，線粒體膜電位水平變化不明顯。用N

5、H4Cl、NAC、地昔帕明和抑胃肽四種干預(yù)劑預(yù)處理后，EA引起的DNA鏈斷裂、細(xì)胞內(nèi)ROS以及溶酶體膜通透都有明顯地減弱，說明上述四種干預(yù)劑的保護(hù)作用十分顯著。
　　 結(jié)論:
　　 高濃度EA能夠引起細(xì)胞DNA損傷，對HEK-293細(xì)胞具有DNA損傷毒性。EA可引起HEK-293細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加，細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)GSH減少，使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，并使HEK-293細(xì)胞內(nèi)氧化性DNA損傷標(biāo)志性產(chǎn)物8-OHdG表達(dá)增強(qiáng)