原發(fā)性膽汁性肝硬化的機制研究及愈肝方聯(lián)合熊去氧膽酸的療效評價.pdf

1、目的：
　　原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary billary cirrhosis，PBC)的定義是一種進行性的，慢性的肝內(nèi)膽汁淤積性疾病，是以肝細胞內(nèi)中、小膽管的非化膿性炎癥，以及在血清中抗線粒體抗體(Anti-mitochondrial antibody，AMA)呈高滴度表現(xiàn)為主要特征的自身免疫性肝病，PBC發(fā)病機制仍未完全闡明，但公認的是，免疫因素在其發(fā)病機制中發(fā)揮著十分重要的作用。白細胞介素-33（Interleukin-

2、33，IL-33）是一種在固有免疫和獲得性免疫中均具有廣泛效應(yīng)的細胞因子。IL-33通過其受體ST2信號途徑，促進了Th2類細胞因子、促炎細胞因子(IL-8、IL-1β)和組胺的釋放。另外，能直接作用于中性粒細胞的IL-33，通過上調(diào)中性粒細胞表面趨化因子受體（CXCR2）的表達，從而增強中性粒細胞的遷移能力。
　　然而在PBC疾病研究中，有關(guān)IL-33的相關(guān)作用研究尚無相關(guān)報道，IL-33的表達特征及其對中性粒細胞的作用也不清楚

3、，兩者與PBC患者疾病的嚴重程度，以及肝臟組織學(xué)的嚴重程度的關(guān)系仍未闡明。本研究旨在通過初步觀察PBC患者（Child-Pugh A級組21例、Child-Pugh B級組29例及Child-Pugh C級組18例）血清及肝組織內(nèi)IL-33的表達水平及其分布水平，同時觀察PBC患者肝臟組織中IL-33 mRNA的表達水平與肝組織中性粒細胞（MPO+細胞）的浸潤水平的相關(guān)性，并進一步通過體外實驗觀察PBC患者外周血漿中IL-33對中性粒細

4、胞的趨化作用，從而探討IL-33與PBC患者疾病進展的可能機制。
　　方法：
　　1.采用ELISA技術(shù)，檢測PBC患者（Child-Pugh A級組、Child-Pugh B級組、Child-Pugh C級組）血清中IL-33水平，觀察IL-33表達水平與PBC患者肝損傷標(biāo)志ALT、AST、ALP、GGT水平的相關(guān)性，闡明IL-33表達水平與疾病嚴重程度的關(guān)系。
　　2.利用肝臟組織原位免疫組化分析技術(shù)和RT-PCR

5、技術(shù)，檢測PBC患者不同組織學(xué)階段的（早期組：相于I+Ⅱ期、晚期組：相當(dāng)于Ⅲ+Ⅳ期)肝組織內(nèi)IL-33 mRNA以及ST2 mRNA表達水平，觀察IL-33+細胞在PBC患者不同組織學(xué)階段的表達水平以及PBC患者肝臟中中性粒細胞（MPO+細胞）的數(shù)量與IL-33 mRNA水平相關(guān)性。
　　3.通過中性粒細胞趨化實驗，明確PBC患者血漿中IL-33對中性粒細胞的作用效應(yīng)。
　　結(jié)果：
　　1. PBC患者血清中的IL-3

6、3濃度升高
　　與健康對照組（HCs）血清中IL-33表達水平（32.24±8.37 pg/ml）相比，PBC患者血清中IL-33的濃度（69.44±10.70 pg/ml）顯著升高（P<0.001）。此外我們對PBC患者進行Child-Pugh分級，發(fā)現(xiàn)：與Child-Pugh A級組PBC患者血清IL-33水平（57.24±6.55 pg/ml）相比，Child-Pugh B級組和Child-Pugh C級組的IL-33水平明

7、顯升高（74.93±6.56和75.61±7.95 pg/ml）（P<0.001）；而在Child-Pugh B級組和Child-Pugh C級組患者血清IL-33水平則未見明顯差異（P>0.05）。
　　2. PBC患者血清中sST2的濃度升高
　　我們進一步檢測了PBC患者血清中sST2的濃度，發(fā)現(xiàn)與健康對照組（HCs）血清中sST2表達水平（144.94±224.60 pg/ml）相比，PBC患者血清中sST2的濃度（

8、70.47±25.81 pg/ml）顯著升高（P<0.001）。而各Child-Pugh分級組的PBC患者血清sST2濃度無明顯差異（Child-Pugh A級組，1343.84±583.28 pg/ml、Child-Pugh B級組，1438.31±485.42 pg/ml、Child-Pugh C級組，1439.37±503.73 pg/ml）（P>0.05）。3. PBC患者血清IL-33濃度與ALP水平相關(guān)
　　我們進一步

9、對PBC患者血清IL-33水平與其肝生化學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性進行探討，發(fā)現(xiàn)PBC患者血清IL-33濃度與ALP水平顯著相關(guān)（R=0.421，P<0.001），而與ALT、AST及GGT水平無顯著相關(guān)性（R=-0.023、R=-0.071、R=0.158，P值均>0.05）。4. IL-33+細胞增多與PBC患者的組織學(xué)分期密切相關(guān)
　　我們進一步對PBC患者肝組織內(nèi)IL-33原位免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，與HCs肝臟組織相比，PBC患者肝組織中

10、IL-33+細胞數(shù)量顯著增多（P<0.001）。此外，我們進一步探討PBC患者肝組織中IL-33+細胞數(shù)量與PBC患者肝臟病理分期的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)，與PBCⅠ期和PBCⅡ期患者相比，PBCⅢ期和PBCⅣ期患者肝組織中IL-33+細胞浸潤顯著增多（P<0.001）。與此同時，我們發(fā)現(xiàn)IL-33 mRNA的表達水平在PBCⅢ期和PBCⅣ期患者肝組織中，較HCs、PBCⅠ期和PBCⅡ期患者肝組織中水平明顯升高（P<0.001）。
　　5.

11、 PBC患者肝組織內(nèi)中性粒細胞浸潤增加且與其IL-33 mRNA表達水平密切相關(guān)
　　隨后我們對PBC患者肝組織中中性粒細胞的浸潤水平進行探討，肝臟原位免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）+細胞較HCs肝組織中顯著增多（P<0.001）。我們進一步研究發(fā)現(xiàn)，與PBCⅠ期和PBCⅡ期患者相比，PBCⅢ期和PBCⅣ期患者肝組織中MPO+細胞浸潤明顯升高（P<0.001）。與此同時，我們還發(fā)現(xiàn)PBC患者

12、肝組織中MPO+細胞的數(shù)量與其IL-33 mRNA表達水平密切相關(guān)（R=0.81，P<0.001）。
　　6.升高的IL-33促進了中性粒細胞的趨化作用
　　為了進一步確定IL-33對中性粒細胞的作用效應(yīng)，我們進行了中性粒細胞趨化作用的分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與HCs患者的血漿相比，PBC患者的血漿可誘導(dǎo)更多的中性粒細胞遷移（P<0.001）。此外，與PBC患者血漿中培養(yǎng)的中性粒細胞相比，當(dāng)把IL-33加回到PBC患者血漿時，其中性

13、粒細胞的趨化指數(shù)可進一步升高（P<0.001）。
　　結(jié)論：
　　PBC患者的血清IL-33表達水平明顯升高，同時肝組織內(nèi)IL-33+細胞表達水平以及IL-33 mRNA的表達水平也明顯升高，而且與PBC患者疾病進展相關(guān)；PBC患者肝組織內(nèi)中性粒細胞浸潤增多，且與IL-33 mRNA的表達水平相關(guān)，并隨著PBC患者疾病進展浸潤加重，提示中性粒細胞在PBC患者疾病進程中發(fā)揮重要作用；PBC患者的血清sST2表達水平明顯升高，體