攜帶人護(hù)骨素的重組腺相關(guān)病毒感染滑膜細(xì)胞的體外研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以關(guān)節(jié)炎癥為特征的自身免疫性疾病,屬多基因病。病因不清,但免疫和炎癥反應(yīng)過程已比較清楚,滑膜炎癥不僅引起關(guān)節(jié)疼痛和腫脹,而且導(dǎo)致不可逆的骨和關(guān)節(jié)破壞。護(hù)骨素(Osteoprotegerin,OPG),是含有401個(gè)氨基酸殘基的肝素結(jié)合分泌型糖蛋白,其結(jié)構(gòu)與TNF受體(TNFR)超家族的成員具有高度的保守性。實(shí)驗(yàn)表明OPG能夠在全身或局部通過抑制破骨細(xì)胞分化、抑制成熟破骨細(xì)胞的活性并誘導(dǎo)其凋亡等來(lái)增加骨量。OPG

2、基因敲除小鼠成年后表現(xiàn)為嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松,而切除卵巢后的骨質(zhì)疏松小鼠注射重組人OPG兩周后,出現(xiàn)了明顯的骨礦物質(zhì)密度上升和骨量增加。OPG與其配體OPGL(Osteoprotegerin ligand)之間的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合被認(rèn)為是破骨細(xì)胞分化、增殖、凋亡及發(fā)揮生理作用過程中最重要的調(diào)控機(jī)制,提示其在治療骨質(zhì)疏松、癌癥骨轉(zhuǎn)移、高鈣血癥及Paget’s病等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。基因治療是當(dāng)前的研究熱點(diǎn),而基因轉(zhuǎn)移技術(shù)是基因治療的關(guān)健。腺相關(guān)病毒

3、(Adcno-associated virus,AAV)是屬于細(xì)小病毒組的DNA病毒,對(duì)人類沒有致病性。AAV載體呈現(xiàn)很多優(yōu)勢(shì),它能有效感染多種細(xì)胞,包括分裂期和靜息期細(xì)胞,成為基因治療研究中的新熱點(diǎn)。 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了表達(dá)人OPG的復(fù)制缺陷性腺相關(guān)病毒,證實(shí)其在體外具有抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收的活性,并研究了病毒感染人滑膜成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(synovialmembrance fibroblast-Iike cell,FLS)后,O

4、PG蛋白分泌表達(dá)的時(shí)限及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 第一部分 攜帶人護(hù)骨素的重組腺相關(guān)病毒(rAAV-hOPG)的構(gòu)建及滴度測(cè)定 目的：構(gòu)建攜帶人護(hù)骨素的重組腺相關(guān)病毒。 方法：構(gòu)建重組pSNAV2.0-hOPG質(zhì)粒,重組pSNAV2.0-hOPG質(zhì)粒用PCR、酶切和測(cè)序鑒定,然后用pSNAV2.0-hOPG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,經(jīng)克隆斑挑取,腺相關(guān)病毒顆粒擴(kuò)增、純化和鑒定等系列方法,制備高滴度、高純度的腺相關(guān)病毒顆

5、粒。 結(jié)果：制備的rAAV-hOPG滴度為1011pfu/ml。 結(jié)論：制備rAAV-hOPG方法簡(jiǎn)單、可靠,制成的rAAV-hOPG滴度很高。 第二部分 離體研究人滑膜成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞感染腺相關(guān)病毒后生物活性 目的：研究rAAV-hOPG能否體外感染人FLS及其對(duì)細(xì)胞的功能影響。 方法：將人FLS在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至80％匯片,細(xì)胞計(jì)數(shù)后,移除培養(yǎng)液,加入

6、1mL經(jīng)培養(yǎng)液稀釋的病毒液,以每個(gè)細(xì)胞加入約10個(gè)pfu的病毒計(jì)算,繼續(xù)培養(yǎng)。RealTime-PCR檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄,Western blot及ELISA檢測(cè)有無(wú)OPG蛋白表達(dá)。 結(jié)果:RealTime-PCR證實(shí)病毒感染后,OPG基因轉(zhuǎn)錄水平增高,Western blot及ELISA檢測(cè)證實(shí)有OPG蛋白的表達(dá),并可在細(xì)胞培養(yǎng)上清中持續(xù)表達(dá)8周。感染OPG重組腺相關(guān)病毒的滑膜成纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好、細(xì)胞周期無(wú)明顯變化。

7、結(jié)論：攜帶OPG重組腺相關(guān)病毒能有效感染人FLS,感染后的細(xì)胞能夠表達(dá)較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)表達(dá)OPG蛋白。 第三部分 小鼠破骨細(xì)胞細(xì)胞的培養(yǎng)及骨吸收陷窩形成實(shí)驗(yàn) 目的：探討rAAV-hOPG對(duì)破骨細(xì)胞形成及功能的影響。 方法:lα,25(OH)2D3、地塞米松將骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)成破骨細(xì)胞,將重組腺相關(guān)病毒加入體外培養(yǎng)的小鼠骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)基中,破骨細(xì)胞樣細(xì)胞的TRAP染色及骨吸收功能檢測(cè),計(jì)數(shù)誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞數(shù)量及在牙質(zhì)片