重組腺相關(guān)病毒對造血干細(xì)胞高效轉(zhuǎn)導(dǎo)的優(yōu)化.pdf

1、目的:重組腺相關(guān)病毒(rAAV)被認(rèn)為是最具應(yīng)用前景的基因治療病毒載體，應(yīng)用其進(jìn)行β-地中海貧血治療是一項(xiàng)具有極大的應(yīng)用價值的研究。然而rAAV感染效率低下一直是困擾研究者的難題，特別是對本身就難以感染的造血干細(xì)胞來說，其感染效率更加不理想。本研究從rAAV的包裝到感染各過程進(jìn)行研究探索，對比優(yōu)化其包裝及感染過程中的材料方法，并進(jìn)行改進(jìn)。致力于獲得高效感染造血干細(xì)胞的AAV病毒及感染條件。
　　 方法與結(jié)果:本研究主要集中于病毒

2、包裝過程和感染過程的優(yōu)化與改進(jìn)。在病毒的包裝中，本實(shí)驗(yàn)分別采用PEI轉(zhuǎn)染法及磷酸鈣轉(zhuǎn)染法包裝病毒;超速離心層析純化法及肝素-瓊脂糖親和純化法純化rAAV病毒，qPCR法及斑點(diǎn)雜交法進(jìn)行病毒滴度測定，對比各種方法對rAAV感染活性的影響及區(qū)別，對rAAV病毒包裝過程造成rAAV活性降低的步驟予以優(yōu)化及改進(jìn)，獲得了一套完整的優(yōu)化的包裝高活性高感染效率的rAAV包裝體系。在感染過程中的優(yōu)化階段，引入了自身互補(bǔ)腺相關(guān)病毒(scrAAV)，同時結(jié)

3、合采用rAAV外殼突變技術(shù)，對rAAV衣殼蛋白上暴露的酪氨酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，獲得外殼突變型rAAV，很大的提高了rAAV對造血干細(xì)胞的感染效率。與此同時，在感染的過程中，發(fā)現(xiàn)感染體系中的各個感染條件對于rAAV的感染效率有十分大的影響。于是對感染條件:感染時間、血清濃度、感染滴度及感染后處理等進(jìn)行了詳細(xì)的探索，發(fā)現(xiàn)他們之間存在著復(fù)雜的相互影響，經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化得到一個針對于造血干細(xì)胞的感染體系，相對以前的感染體系，大幅提高了感染效率。