黃花蒿EβF合成酶基因及麥長(zhǎng)管蚜蛻皮素受體基因USP和EcR的克隆和遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、麥蚜是小麥生產(chǎn)中的主要害蟲(chóng)，蚜蟲(chóng)危害還能傳播各種病毒病，造成小麥減產(chǎn)和品質(zhì)下降。本研究利用已經(jīng)分離克隆到的黃花蒿(Artemisia annua)的[反]-β-法尼烯（EβF）合成酶基因，構(gòu)建農(nóng)桿菌表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因小麥。此外分離克隆了麥長(zhǎng)管蚜蛻皮素受體基因(EcR)和超氣門蛋白基因(USP)，合成上述基因dsRNA后進(jìn)一步飼喂蚜蟲(chóng)，研究了RNAi干涉上述基因的效果及構(gòu)建干擾上述基因載體轉(zhuǎn)化小麥，實(shí)現(xiàn)小麥抗蚜的可行性

2、。主要研究結(jié)果如下:
　　1.利用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)克隆到的黃花蒿EβF合成酶基因(HHH)，采用DNA重組技術(shù)構(gòu)建了融合該基因的雙元表達(dá)載體185 HHH-167 Bar。
　　2.以六倍體小麥KN199為受體材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥幼胚的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，建立了表達(dá)EβF合成酶基因（HHH）的7個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，分別為K01-1-1、K01-3-5、K01-1-6、K02-1-4、K02-5-4、KHH-1-5和KH-5。上述株系均具有

3、Bar抗性。另獲得未檢測(cè)到EβF合成酶基因（HHH）但Bar基因呈陽(yáng)性的5個(gè)株系，分別為K01-3-6、K02-2-5、K02-3-4、K03-1-1和K06-3-4。以獲得的EβF合成酶轉(zhuǎn)基因株系為材料，對(duì)HHH的功能和表達(dá)特性進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)基因植株蚜蟲(chóng)趨避特性及供試基因?qū)μ鞌车挠绊懙於嘶A(chǔ)。
　　3.根據(jù)序列保守區(qū)設(shè)計(jì)基因擴(kuò)增特異引物，克隆了麥長(zhǎng)管蚜蛻皮素受體基因EcR和超氣門蛋白基因USP。以麥長(zhǎng)管蚜的cDNA

4、為模板，使用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒合成了上述基因的dsRNA。
　　4.利用合成的EcR和USP的dsRNA進(jìn)行了蚜蟲(chóng)飼喂和抗蚜研究，期間以飼喂干擾蚜蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育導(dǎo)致蚜蟲(chóng)生殖死亡的唾液腺表達(dá)基因COO2和飼喂綠色熒光蛋白基因GFP分別作陽(yáng)性和陰性對(duì)照。結(jié)果表明，飼喂7.5 ng/μLEcR和USP dsRNA濃度抗蚜效果顯著，誘發(fā)的蚜蟲(chóng)死亡率與喂食COO2的效果相當(dāng)。表明EcR和USP具有顯著的抗蚜效果。
　　5.用EcR和USP d