白樺纖維素合成酶基因BpCesA4的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、纖維素合成酶(cellulose synthase，簡稱CesA)以UDP-葡萄糖為底物，催化葡萄糖聚合為葡聚糖苷鏈，在纖維素合成中具有非常重要的作用。CesA基因以多基因家族的形式存在。通過對白樺CesA基因推導的氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，它們具有植物纖維素合成酶基因相應的結構特征:鋅指結構;8個跨膜結構域，其中兩個位于N端，6個位于C端;兩個易變區(qū)HVRⅠ和HVRⅡ;植物纖維素合成酶基因保守區(qū)P-CR;4個糖基結合位點。為了研究白樺纖

2、維素合成酶基因在高等植物中發(fā)揮的作用，探討纖維素合成酶的保守性及表達情況，本研究以白樺的纖維素合成酶BpCesA基因的全長序列為試驗材料，并研究該基因在高等植物煙草中的表達情況。該研究主要針對本實驗室利用RACE技術克隆的全長基因CesA4、對其進行高效過量表達載體構建、農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因操作、PCR檢測和Sorthern雜交以及轉(zhuǎn)基因等試驗工作，為深入研究白樺纖維素合成酶基因BpCesA4作用的分子機理奠定基礎。本研究的主要結果如下：

3、
　　1.白樺纖維素合成酶基因BpCesA4過量表達載體的構建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化:針對獲得的全長白樺纖維素合成酶基因，選取載體pDONRTM221作為初步載體，載體pH7GWIWG2(Ⅱ)構建過量表達載體。經(jīng)過PCR產(chǎn)物與過量表達載體的連接反應以及反應后目的基因克隆的篩選及鑒定等步驟，得到結果表明:獲得的克隆能擴增出有效產(chǎn)物，條帶分布在3000bp，與預期的插入片段大小吻合，可以進行序列測序。測序結果經(jīng)上網(wǎng)比對，與目的片段完全一致，證明

4、已經(jīng)獲得實驗需要的過量表達載體，完成了白樺纖維素合成酶基因BpCesA4過量表達載體的構建。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，采用電轉(zhuǎn)儀電擊的方式將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株中。轉(zhuǎn)化后進行PCR檢測。電泳檢測結果顯示，所獲得的重組表達載體已經(jīng)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105中。可以進行下一步農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因操作。
　　2.農(nóng)桿菌介導的白樺纖維素合成酶基因BpCesA4轉(zhuǎn)化煙草:通過農(nóng)桿菌EH105介導，進行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。建立并優(yōu)化了煙草的組織培養(yǎng)高頻再生體系

5、和遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，討論了侵染時間、共培養(yǎng)時間、抑菌操作抗生素的選擇、以及潮霉素篩選過程中抗生素濃度的篩選等問題，以及其對白樺外植體轉(zhuǎn)化率的影響，篩選出最佳的處理組合，并獲得了篩選后長勢良好的轉(zhuǎn)基因煙草植株，為后續(xù)分子生物學檢測做好準備
　　3.轉(zhuǎn)基因煙草的檢測:采用PCR檢測以及Southern-blot對PCR確定的轉(zhuǎn)化植株進行鑒定。結果表明經(jīng)PCR檢測確定的陽性轉(zhuǎn)化植株中，均為陽性。陽性轉(zhuǎn)化植株的轉(zhuǎn)化拷貝數(shù)為單拷貝整合，證明目的