幽門螺桿菌感染對胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的影響和菌群分布特征的研究.pdf

1、人體消化道中存在著眾多的細(xì)菌，能達(dá)到1014數(shù)量級[1]，這些細(xì)菌在胃腸這個(gè)特殊的腔道內(nèi)與其他一些理化因素一起，構(gòu)成了胃腸微環(huán)境，其正常運(yùn)作與否，對人體的健康有著舉足輕重的影響[2，3]。人體微生態(tài)學(xué)(Human microecology)是研究人體內(nèi)正常微生物的結(jié)構(gòu)、功能以及與其宿主相互關(guān)系的學(xué)科，它作為生命學(xué)的重要組成部分，在認(rèn)識疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后過程中發(fā)揮日漸重要的作用[4，5]。
　　 幽門螺桿菌(Helicobac

2、ter pylori，Hp)感染機(jī)體后，可導(dǎo)致胃部多種疾病，包括胃炎、消化道潰瘍，與胃癌的產(chǎn)生、發(fā)展也密切相關(guān)[6-8]。但為何Hp感染人體后并不都引發(fā)疾病發(fā)生，又為何出現(xiàn)不同的臨床轉(zhuǎn)歸，其機(jī)制仍然不清楚[6]。愈來愈多證據(jù)表明Hp菌株與宿主、環(huán)境等多方面因素共同作用決定了胃部疾病的發(fā)生[9-12]。菌群結(jié)構(gòu)作為胃腸微環(huán)境的重要組成部分，其通過多種調(diào)控系統(tǒng)和途徑維持胃腸微環(huán)境的穩(wěn)定和平衡[6]。一旦菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這種平衡勢必被打破，

3、就會(huì)導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生[13]。因此，作為定植 于胃內(nèi)微環(huán)境的Hp，其能否引起胃內(nèi)菌群等微環(huán)境的改變而引發(fā)疾病，胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)又是如何改變？解決以上問題將有助于探明Hp的致病機(jī)制，也將有助于探索Hp相關(guān)疾病的新的生態(tài)治療方法。
　　 因此，本文擬通過流行病學(xué)調(diào)查、蒙古沙鼠模型建立、PCR-DGGE(聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù))以及分子微生態(tài)學(xué)等手段和方法，研究胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)及其與Hp定植及相關(guān)疾病的關(guān)系，為Hp感染及其相關(guān)疾病特

4、別是胃癌的防治提供新的微生態(tài)調(diào)節(jié)思路。具體分為以下三個(gè)部分：
　　 1.Hp感染蒙古沙鼠胃粘膜菌群結(jié)構(gòu)變化的研究。
　　 胃內(nèi)因存在胃酸、胃蛋白酶和胃蠕動(dòng)等理化因素，微環(huán)境較為特殊，pH值一般處于2.0左右[14]，抑制了大部分細(xì)菌的生長，這就形成了胃內(nèi)獨(dú)有的菌群結(jié)構(gòu)和胃內(nèi)微環(huán)境[14，15]。作為胃內(nèi)微環(huán)境重要組成部分的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)，其在Hp感染前后的變化必定對胃內(nèi)微環(huán)境有著重要的影響。本實(shí)驗(yàn)以蒙古沙鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立H

5、p定植模型，并應(yīng)用PCR-DGGE及測序等分子生物學(xué)技術(shù)研究Hp定植前后胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的變化及其與Hp定植之間的相互影響關(guān)系。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物模型中，Hp的定植會(huì)引起胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的改變。這種改變主要體現(xiàn)在以下兩個(gè)方面：1)菌群的種類和數(shù)量上都會(huì)受到因Hp定植而帶來的影響。胃內(nèi)主要菌種的主導(dǎo)地位不會(huì)受到影響，但Hp定植會(huì)競爭性抑制一部分細(xì)菌生長而引起菌群結(jié)構(gòu)改變，其中以乳桿菌較為明顯；2)經(jīng)過預(yù)處液處理過的胃內(nèi)環(huán)境遭到破壞，菌

6、群種類和數(shù)量大幅度減少，Hp的定植又會(huì)在一定程度上改變胃內(nèi)微環(huán)境，會(huì)對原本被預(yù)處理液清除的一些菌種起一個(gè)促進(jìn)恢復(fù)的作用。Hp的定植對胃內(nèi)菌群的影響表現(xiàn)出抑制和促進(jìn)兩個(gè)方面。
　　 2.乳桿菌對Hp感染蒙古沙鼠胃粘膜菌群結(jié)構(gòu)的影響。
　　 強(qiáng)力抗生素輔以PPI或H2受體阻斷劑等藥物用于治療Hp感染面臨諸多困難，如耐藥、依從性差等[16，17]。微生態(tài)調(diào)節(jié)治療逐漸受到研究者的重視。體外實(shí)驗(yàn)研究表明，乳桿菌對Hp有明顯的抑制作

7、用，且抑制作用的效果與乳桿菌相對濃度呈正相關(guān)，其對Hp的抑制作用機(jī)制與益生菌的代謝產(chǎn)物有關(guān)[18]。但是，目前對乳桿菌與Hp的作用主要都是通過體外實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行研究[19]，體內(nèi)尚無明確證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)建立Hp感染沙鼠模型，觀察乳桿菌菌株對感染模型進(jìn)行灌胃治療的效果，并運(yùn)用PCR-DGGE及后續(xù)測序比對技術(shù)分析灌胃治療前后沙鼠胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的變化，獲得乳桿菌與Hp相互作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，用三株分離自正常沙鼠胃內(nèi)的乳桿菌菌

8、株制備成混懸菌液，對Hp感染沙鼠模型進(jìn)行灌胃后，發(fā)現(xiàn)乳桿菌菌株能在較短時(shí)間內(nèi)(2周)清除沙鼠胃內(nèi)Hp定植，清除率達(dá)到60%左右。此外還能緩解并控制Hp感染相關(guān)疾病癥狀。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，單純的乳桿菌灌胃治療，并不能改善因Hp感染而破壞的胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果為Hp感染相關(guān)疾病的胃內(nèi)微生態(tài)調(diào)劑治療奠定了一定基礎(chǔ)。
　　 3.Hp感染相關(guān)疾病人群胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)差異的比較分析。
　　 通過前兩部分對Hp感染動(dòng)物模型的研究發(fā)現(xiàn)，Hp的定

9、植會(huì)引起胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的改變，這種改變主要表現(xiàn)在抑制和促進(jìn)兩個(gè)方面，且乳桿菌菌株能在較短時(shí)間內(nèi)清除Hp的定植。那么這種現(xiàn)象是否在人體胃內(nèi)同樣存在？因人胃內(nèi)同樣存在著自身特定的菌群結(jié)構(gòu)，目前Hp的高感染率和其相關(guān)疾病的發(fā)病率明顯不一致，而且臨床病例研究發(fā)現(xiàn)，Hp感染致病人群各自的臨床表現(xiàn)也大相徑庭[14，20]，本研究擬從微生物生態(tài)學(xué)角度出發(fā)，應(yīng)用PCR-DGGE及相關(guān)測序等分子生物學(xué)技術(shù)研究不同臨床表型人群間胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的差異。
　

10、　 本研究發(fā)現(xiàn)，在Hp感染相關(guān)疾病中，胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)與Hp定植和疾病均有關(guān)系：1)隨著病程的發(fā)展和病情嚴(yán)重程度的加重，胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生明顯變化，菌群種類數(shù)量會(huì)明顯減少，胃癌患者胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)相對更加單一；2)Hp定植情況也會(huì)對菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，雖然有無Hp定植在胃內(nèi)菌群種類數(shù)量之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但不同胃內(nèi)疾病條件下，有H定植相對于無Hp定植的胃內(nèi)菌群種類均有減少的趨勢。這些結(jié)果提示，從研究胃內(nèi)微生態(tài)的角度出發(fā)，通過重建胃