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文檔簡介
1、目的: 1.觀察大黃素對K562細胞增殖和凋亡的影響。探討大黃素抑制K562細胞增殖并誘導其凋亡的分子機制。 2.通過甲基化反應對大黃素進行結構改造,并對新衍生物的抗腫瘤活性及其作用的分子機制進行初步研究。 方法: 1.1 MTT法檢測不同濃度大黃素處理K562細胞24h,48h,72h后細胞增殖情況。 1.2聯(lián)合應用瑞氏染色法,AnnexinV-FITC/PI雙染法,電子顯微鏡和TUNEL法檢測
2、大黃素對K562細胞凋亡的影響。 1.3流式細胞儀測定大黃素作用K562細胞24h,48h后細胞周期變化。 1.4分光光度法測定大黃素作用K562細胞48h后Caspase-3,-8,-9活性。 1.5 RT-PCR測定大黃素作用K562細胞48h后Caspase-3 mRNA的表達。 2.1以大黃素為原料,分別通過硫酸二甲酯和碳酸二甲酯兩種不同的甲基化試劑甲基化后合成新的大黃素1,3,8-三甲氧基-6-
3、甲基蒽醌。采用HPLC及ESI-MS對其結構進行表征,并對兩種甲基化試劑的反應產率進行比較。 2.2用不同濃度大黃素及三甲氧基衍生物溶液對K562細胞進行處理,通過MTT比色法檢測細胞增殖抑制率,流式細胞儀分析細胞周期的改變。 結果: 1.大黃素及大黃素三甲氧基衍生物均能抑制K562細胞增殖,其作用呈現(xiàn)出一定的時效和劑量關系且低濃度下大黃素三甲氧基衍生物的抑制作用強于大黃素。 2.大黃素作用后的細胞在普通
4、光鏡下可見典型的凋亡形態(tài)學改變。40μmol/L大黃素作用K562細胞48h電子顯微鏡觀察出現(xiàn)典型的凋亡細胞形態(tài)學改變,包括核固縮、核碎裂、核扭曲等,同時TUNEL法檢測可見典型的核深染細胞。Annexin V-FITC/PI雙染法檢測結果顯示,40,60μmol/L大黃素作用K562細胞12h能誘導其凋亡,細胞凋亡率分別為(8.89±0.21)%、(26.06±0.13)%,與對照組比較,差異具有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
5、 3.大黃素作用K562細胞24h,G0/G1期細胞百分比增高,細胞阻滯于G0/G1期。三甲氧基衍生物作用K562細胞48h后,細胞周期G0/G1細胞比例增加,S期細胞比例降低。 4.40μmol/L大黃素作用K562細胞72h,Caspase-3,-8,-9活性明顯升高,與對照組比較,差異具有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 5.RT-PCR結果顯示,大黃素處理后的K562細胞,其Caspase-3mRNA表達上
6、調。 結論: 1.大黃素能抑制K562細胞增殖,其作用呈現(xiàn)出一定的時效和劑量關系。大黃素可能通過使K562細胞阻滯于G0/G1期而抑制細胞增殖。同時大黃素可能通過線粒體途徑、死亡受體途徑和內質網途徑,激活Caspase-9進而活化Caspase-3及激活Caspase-8誘導K562細胞凋亡。 2.三甲氧基衍生物可能通過阻滯K562細胞周期由G0/G1向S期移行的機制來抑制細胞的增殖。在低濃度下,三甲氧基衍生物的
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