補體攻膜復合物C5b-9對人外周血單核細胞來源樹突狀細胞分化成熟及免疫學功能的影響.pdf

1、補體(complement)系統(tǒng)作為天然免疫(innate immunity)中的一類重要和保守的體系，當病原微生物或炎癥介質存在時可被激活最終通過末端成分組裝成C5b-9膜攻擊復合物(membrane attack complex，MAC)，為機體提供了快速和高效的清除入侵微生物的途徑。MAC是一種多效免疫因子，在補體大量活化后，可插入細胞膜導致細胞溶破死亡，而近年來通過對MAC與有核細胞相互作用的研究，這一觀點已發(fā)生改變。實驗證明：

2、有核細胞能通過囊泡化或內(nèi)吞作用，清除沉積于細胞膜上的MAC，保護自身免遭補體溶破，此時的MAC稱為亞溶破MAC(sublytic MAC，sMAC)。體外的研究也證實，亞溶破劑量的MAC對多種有核細胞具有刺激和活化作用。近來新的研究發(fā)現(xiàn)，非致死劑量的MAC可沉積于中性粒細胞，單核細胞等多種有核細胞，刺激細胞發(fā)生多種代謝改變，包括分泌氧自由基、類脂質等炎癥介質，并誘導細胞因子、黏附分子以及其他功能蛋白的表達等。補體系統(tǒng)除了補體的直接殺傷機

3、制外，在補體活化過程中釋放的多種小片斷分子具有廣泛的生物學效應，包括趨化中性粒細胞和淋巴細胞、調(diào)理吞噬、參與調(diào)節(jié)細胞和體液免疫應答等等。因此，補體是連接機體天然免疫和獲得性免疫(adaptive immunity)的“橋梁”。 樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是體內(nèi)功能最強的專職抗原遞呈細胞(antigen-presenting cells，APC)，能高效的攝取、加工處理和提呈抗原，具有較強的遷移能力，并能顯著

4、地激活初始型T細胞以啟動T細胞免疫應答反應，在免疫應答中處于中心調(diào)控地位。此外，DC與B細胞以及NK細胞等也存在著相互作用，可見，DC在連接天然免疫和獲得性免疫之間起著非常重要的作用。DC是一類異質性的細胞群體，不同的亞群，不同的成熟狀態(tài)，其免疫學功能特點不同，在免疫應答與免疫耐受、抗腫瘤、抗感染免疫中發(fā)揮不同的作用。多種外源或內(nèi)源因素均可調(diào)節(jié)：DC的分化發(fā)育，刺激其成熟以及免疫學功能。但到目前為止，還未見補體攻膜復合物C5b-9與樹突

5、狀細胞相互作用，特別是補體C5b-9是否影響樹突狀細胞分化發(fā)育成熟已經(jīng)免疫學功能的相關報道。 有研究顯示，血液中樹突狀細胞表面有補體攻膜復合物C5b-9沉積，甚至在培養(yǎng)幾天后還能檢測到，且樹突狀細胞的活力也未受影響，在人的濾泡樹突狀細胞所處的淋巴細胞生發(fā)中心也發(fā)現(xiàn)了補體攻膜復合物。既然補體和DC均能夠連接天然免疫和獲得性免疫，且在DC的表面又有C5b-9的沉積，因此我們推測，補體有可能通過調(diào)節(jié)DC分化發(fā)育成熟以及免疫學功能調(diào)節(jié)機

6、體的免疫應答。為證實這一設想，我們設計并進行了本研究。本研究的完成有助于在免疫應答的調(diào)控機制方面獲得新的認識，并對補體和DC之間在連接天然免疫和獲得性免疫之間的作用及相互關系能有更全面的了解，為進一步從新的角度和思路深入研究DC在抗原特異性免疫應答與免疫耐受中的作用及機制奠定基礎。 為明確亞溶破C5b-9(sublytic C5b-9，sC5b-9)對樹突狀細胞分化發(fā)育影響，本研究共分三部分： 第一部分，外周血單核來源樹

7、突狀細胞的誘導。選取38例健康志愿者外周血白膜，F(xiàn)icoll密度梯度離心獲得外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，貼壁法分離純化獲得較純的單核細胞(monocyte)，在GM-CSF(50ng/ml)和IL-4(25ng/ml)聯(lián)合作用下誘導分化為未成熟樹突狀細胞(immaure dendritic cell,imDC)，于誘導的第5d，通過鏡下觀察細胞形態(tài)以及流式檢測表面標志

8、，結果顯示，貼壁后CD14<'+>單核細胞百分率達87％以上，rhGM-CSF+rhIL-4誘導后，細胞CD1a表達上調(diào)，CD14表達下降，說明誘導所獲細胞未典型imDC，建立了穩(wěn)定的體外DC培養(yǎng)體系。 第二部分，建立體外DC亞溶破模型。利用C5b6、C7、C8、C9補體蛋白純品，imDC膜表面組裝C5b-9，觀察細胞的狀態(tài)，激光共聚焦檢測C5b-9在imDC膜上的組裝情況，流式檢測組裝C5b-9后DC的凋亡情況，LDH釋放檢測

9、C5b-9對DC的溶破效應。結果顯示，C5b-9在imDC膜上組裝成功，當C5b6濃度小于0.8μg/ml時，C5b-9對DC膜的完整性沒有影響，但當大于0.8μg/ml時，膜完整性隨著C5b6濃度的增加破壞加劇，因此確定了C5b-9對DC的體外亞溶破劑量為用小于0.8μg/ml C5b6，10μg/mlC7，10μg/ml C8，10μg/ml C9組裝的C5b-9，成功建立體外DC亞溶破模型。 第三部分，sC5b-9對imD

10、C成熟以及免疫學功能的影響。imDC膜上組裝sC5b-9，刺激3d后，流式檢測細胞表面的成熟分化標志，HLA相關抗原以及共刺激分子的表達；流式分析抗原捕獲能力以及抗原捕獲相關分子；ELISA檢測sC5b-9處理DC細胞因子分泌情況：與同種異體CD4<'+>T、CD8<'+>T或CD4+CD45RA<'+>T細胞共培養(yǎng)，通過流式分析DC刺激的CD4<'+>T、CD8<'+>T等表面活化標志、ELISA檢測CD4<'+>T、CD8<'+>T

11、或CD4<'+>CD45RA<'+>T細胞因子分泌情況，明確DC激活T細胞的能力。在各個實驗時LPS(1μg/ml)、C5b-8，C5b-7，C5b6，C7，C8，C9同時用于實驗。結果顯示：與未刺激組相比，sC5b-9處理。DC表面分化標志CD14及CD1a變化不顯著，成熟標志CD83、HLA相關抗原、共刺激分子CD80、CD86、B7-H1、B7-H3、B7-H4、BTLA等表達上調(diào)；sC5b-9處理DC分泌IL-12及TNF-α上

12、調(diào)，抗原捕獲能力及抗原捕獲相關分子降低；sC5b-9處理DC刺激CD4<'+>T活化及分泌IFN-γIL-2能力增強，IL-10變化不顯著，但sC5b-9處理DC刺激CD8<'+>T活化及分泌IFN-γ、IL-2、IL-10均不顯著；sC5b-9處理DC與CD4<'+>CD45RA<'+>T共培養(yǎng)后檢測細胞因子分泌，發(fā)現(xiàn)CD4<'+> CD45RA<'+>T分泌IL-4降低而IFN-γ增加。以上結果表明，sC5b-9促進的DC成熟，誘導

13、了Th1極化。 通過以上三部分的研究，我們得出如下結論： 直接貼壁法能獲得相對較純的單核細胞，利用rhGM-CSF聯(lián)合rhIL-4貼壁的單核細胞，隔日半量補充細胞因子，在第5d能獲得典型的imDC。 利用補體蛋白純品C5b6、C7、C8、C9在合適條件下能體外于imDC膜表面組裝C5b-9，當補體純品C5b6濃度小于0.8ug/mL時，組裝的C5b-9為亞溶破型。 sC5b-9能促進imDC向成熟DC轉變

14、，同時抗原捕獲能力降低，IL-12和TNF-α分泌上調(diào)；sC5b-9處理DC同種異體混合淋巴細胞反應能力增加，激活CD4<'+>T細胞能力提高并誘導初始T細胞Th1極化。 綜上所述，作為天然免疫重要組成部分的補體系統(tǒng)，除了能夠直接殺傷入侵的病原微生物外，還可以通過在活化形成的攻膜復合物C5b-9調(diào)控機體內(nèi)最重要的抗原提呈細胞-DC的成熟以及免疫學功能，從而發(fā)揮免疫調(diào)控作用。上述研究結果對于深入認識天然免疫和獲得性免疫之間的作用以