NVP-BEZ235對(duì)CD34+CD38-髓系白血病干細(xì)胞的增殖抑制和免疫增敏.pdf

1、研究背景：
　　 白血病在我國(guó)發(fā)病率約為4-5/10萬(wàn)，他是導(dǎo)致是青少年死亡的首位疾病，它是在造血過(guò)程中由于某一階段細(xì)胞克隆擴(kuò)增而產(chǎn)生的造血系統(tǒng)惡性疾病。近來(lái)，隨著環(huán)境污染的逐漸加劇，累積損傷造成白血病發(fā)病率越來(lái)越高，難治性越來(lái)越強(qiáng)。白血病是較常見(jiàn)的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，是一種造血系統(tǒng)紊亂性疾病。目前治療白血病的方法主要有放療、化療和骨髓移植等，但這幾種方法都面臨著愈后復(fù)發(fā)的問(wèn)題。Bonnet D等首次從AML患者骨髓中首次分離出C

2、D34+CD38-表型的白血病細(xì)胞亞群，并將該表型的細(xì)胞移植給非肥胖性糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠。發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞群有強(qiáng)大的自我更新及增殖特點(diǎn)，它能啟動(dòng)除急性早幼粒細(xì)胞白血病(M3)外各型AML的形成，并在二次移植受體鼠體內(nèi)觀察到同樣的結(jié)果。至此，人們開(kāi)始認(rèn)識(shí)到白血病患者體內(nèi)存在白血病干細(xì)胞(LSC)被認(rèn)為是白血病發(fā)生、發(fā)展及治療后復(fù)發(fā)的根源，其原因?yàn)榘籽「杉?xì)胞(LSC)具有自我更新、多分化潛力及增殖強(qiáng)等特性。目前急性

3、髓系白血病(AML)占白血病的60％。除M3型外，AML各個(gè)型別（M0-M5）來(lái)源的LSC均表達(dá)相同的免疫表型CD34+CD38-，這與正常骨髓HSC表面特征相似。白血病干細(xì)胞處于細(xì)胞克隆初始階段，與白血病細(xì)胞的惡性增殖相關(guān)，在白血病的發(fā)生和發(fā)展起關(guān)鍵作用。由于白血病干細(xì)胞處于細(xì)胞分裂的休眠期，使其對(duì)常規(guī)劑量藥物和放射損傷產(chǎn)生強(qiáng)大的抵抗力，甚至對(duì)人體致死劑量藥物和全身照射也產(chǎn)生耐受和抵抗。臨床上的治療的指導(dǎo)思想增強(qiáng)放化療力度以往往是盡可

4、能提高殺滅白血病細(xì)胞的數(shù)目。這樣的治療往往缺乏靶向性，這樣的治療不僅僅有很大的盲目性，而且很難達(dá)到真正的治愈，不僅浪費(fèi)了醫(yī)療資源，而且給患者及家屬帶來(lái)了精神上及經(jīng)濟(jì)上不必要的痛苦。所以只有靶向白血病干細(xì)胞或提高白血病干細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性，才能徹底治療白血病、預(yù)防緩解后復(fù)發(fā)提高長(zhǎng)期存活率，達(dá)到真正意義上的生物學(xué)緩解。因此目前急需尋找能夠靶向白血病干細(xì)胞提高化療有效性的藥物或者新的治療手段以最大限度的清除耐藥和免疫抵抗的白血病細(xì)胞，預(yù)防復(fù)

5、發(fā)。
　　 PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。PI3K之所以作為治療腫瘤的靶點(diǎn)引人注目，主要是因?yàn)樗幱诒姸嗾{(diào)節(jié)細(xì)胞功能的眾多重要信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)位置。磷酸肌醇3-激酶（PI3K: phosphatidyinositol3-kinase）是一個(gè)脂激酶家族，目前多指Ⅰ型PI3K，它們可以催化PIP2磷酸化成為PIP3從而激活下游的蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(AKT: prot

6、ein-serine-threonine kinase)。AKT又可磷酸化mTORC1來(lái)促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)，還可以通過(guò)mTORC1來(lái)上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor1α)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子促進(jìn)血管生成。另外AKT也可被mTORC2激活。mTOR(mammalian target of rapamycim)是哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。處于PI3K信號(hào)通路的下游，在細(xì)胞中m

7、TOR以mTOR1和mTOR2的催化亞基形式存在，這兩種復(fù)合物參與細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯起始、核糖體生物合成、細(xì)胞凋亡等過(guò)程。近年來(lái)許多研究表明細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化與該通路的活性異常相關(guān)。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，所以PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的抑制劑作為新型抗腫瘤藥物得到世界的廣泛關(guān)注。NVP-BEZ235是具有咪唑并喹啉結(jié)構(gòu)的ATP競(jìng)爭(zhēng)性PI3K/mTOR混合抑制劑。目前在實(shí)體瘤方面已經(jīng)

8、進(jìn)入Ⅰ期/Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)階段。該藥物的喹啉氮原子與激酶鉸鏈部位形成氫鍵，NVP-BEZ235通過(guò)ATP競(jìng)爭(zhēng)抑制PI3K表現(xiàn)出高度抑制PI3K，它選擇性阻斷PI3K催化亞基p110α和p110γ，在增加濃度下也阻斷mTOR1和mTOR2，也可抑制普通的PI3Kα突變。NVP-BEZ235也可顯著減少mTOR激活P70S6激酶蛋白的磷酸化水平。有研究表明在實(shí)體瘤方面NVP-BEZ235表現(xiàn)出誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及將細(xì)胞周期阻滯在Go/G1期。Schu

9、lt C等發(fā)現(xiàn)NVP-BEZ235聯(lián)合細(xì)胞毒藥物有抗急性淋巴細(xì)胞白血病增殖的作用，Baumann P等發(fā)現(xiàn)NVP-BEZ235對(duì)骨髓瘤有抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖的作用，并與多種藥物如硼替佐米、馬法蘭、阿霉素等有協(xié)同累加作用。然而目前NVP-BEZ235對(duì)CD34+CD38-髓系白血病干細(xì)胞的作用作者仍未見(jiàn)到報(bào)道，既尚不明確NVP-BEZ235能否靶向性殺滅CD34+CD38-髓系白血病干細(xì)胞。因此，我們研究NVP-BEZ235對(duì)CD34+CD

10、38-髓系白血病干細(xì)胞KG1a細(xì)胞株的生物學(xué)特性的影響，為研究NVP-BEZ235治療急性髓系白血病提供一定的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。
　　 腫瘤的發(fā)生經(jīng)歷了免疫監(jiān)視、相互對(duì)抗、免疫逃逸的過(guò)程。免疫系統(tǒng)和腫瘤細(xì)胞之間存在相互作用，免疫系統(tǒng)重塑腫瘤細(xì)胞的抗原性，腫瘤細(xì)胞改變免疫效應(yīng)細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)。白血病之所以能夠發(fā)生，另外一個(gè)主要原因?yàn)榘籽〖?xì)胞能通過(guò)基因突變等多種機(jī)制逃逸體內(nèi)的免疫監(jiān)視。逃逸后的白血病干細(xì)胞獲得克隆性增殖最終發(fā)展為白血病狀態(tài)

11、。自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK細(xì)胞)是骨髓來(lái)源的大顆粒淋巴細(xì)胞，約占人外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)的5％-10％。NK細(xì)胞是機(jī)體抵抗腫瘤的第一道防線，在腫瘤監(jiān)控中占重要地位。NK細(xì)胞過(guò)繼性免疫治療也是目前臨床上腫瘤細(xì)胞免疫治療的重要手段。在病毒感染、惡性轉(zhuǎn)化、化學(xué)刺激和炎性反應(yīng)等壓力誘導(dǎo)下熱休克因子(HSF)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控促進(jìn)MICA/B、ULBP1、ULBP2等分子表達(dá)從而被受體識(shí)別，受體活化后進(jìn)而激活NK細(xì)胞發(fā)殺傷

12、作用。而MICA/B、ULBP1、ULBP2等分子為NK細(xì)胞活化性受體NKG2D的配體。研究表明多種血液腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)一定水平的NKG2D配體，且NK細(xì)胞的殺傷能力與其NKG2D的表達(dá)水平有關(guān)。提高NKG2D介導(dǎo)的NK細(xì)胞對(duì)白血病干細(xì)胞的免疫清除率對(duì)治療白血病及預(yù)防復(fù)發(fā)有重要的作用。如何能通過(guò)藥物調(diào)節(jié)和逆轉(zhuǎn)白血病干細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的抵抗作用，以最大限度的清除白血病干細(xì)胞成為我們下一步要研究的。那么NVP-BEZ235能否調(diào)節(jié)KG1a細(xì)胞

13、被機(jī)體免疫細(xì)胞殺傷敏感性成為本實(shí)驗(yàn)第二部分研究?jī)?nèi)容。
　　 本實(shí)驗(yàn)將從NVP-BEZ235對(duì)CD34+CD38-KG1a細(xì)胞株生物學(xué)特性的影響，以及NVP-BEZ235能否調(diào)節(jié)CD34+CD38-KG1a細(xì)胞被免疫細(xì)胞殺傷的敏感性進(jìn)行研究，從而為NVP-BEZ235對(duì)抗髓系白血病提供體外實(shí)驗(yàn)研究，了解NVP-BEZ235能否增強(qiáng)CD34+CD38-KG1a細(xì)胞被殺傷的敏感性。
　　 第一部分:NVP-BEZ235對(duì)CD3

14、4+CD38-髓系白血病干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　 [目的]探討PI3K/mTOR信號(hào)系統(tǒng)雙靶點(diǎn)抑制劑——NVP-BEZ235對(duì)CD34+CD38-髓系白血病干細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡和集落形成能力的影響
　　 [方法]收集實(shí)驗(yàn)用KG1a細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)急性髓系白血病KG1a細(xì)胞表面CD34和CD38的表達(dá);臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)不同濃度NVP-BEZ235(0μmol/L、0.125μmol/L、0.25μmo

15、l/L、0.5μmol/L、1μmol/L)和不同作用時(shí)間（24小時(shí)、48小時(shí)）對(duì)KG1a細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度NVP-BEZ235(完全空白對(duì)照、0μmol/L、0.125μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L)作用后KG1a細(xì)胞周期及凋亡變化;持續(xù)用藥軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度NVP-BEZ235(0μmol/L、0.125μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L、1

16、μmol/L)對(duì)KG1a細(xì)胞集落形成細(xì)胞的影響。
　　 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±S）表示，NVP-BEZ235對(duì)KG1a細(xì)胞增殖抑制及克隆形成實(shí)驗(yàn)采用方差分析，方差齊時(shí)組間多重比較采用LSD法;不同濃度NVP-BEZ235作用下細(xì)胞周期及凋亡組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)用KG1a細(xì)胞CD34表達(dá)率(％)為98.6±0

17、.17，CD38表達(dá)率(％)為00.01±0.00。為白血病干細(xì)胞發(fā)育水平。DMSO(0μmol/L)對(duì)CD34+CD38-KG1a細(xì)胞的增殖無(wú)影響(P＞0.05)。NVP-BEZ235(0.125～1μmol/L)對(duì)KG1a細(xì)胞增殖抑制呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴(P＜0.05)。NVP-BEZ235持續(xù)接觸24小時(shí)及48小時(shí)的IC50值分別為0.597μmol/L和0.102μmol/L。同一時(shí)間點(diǎn)各濃度組與0μmol/L組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

18、義(P＜0.05);同一濃度不同時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。對(duì)照、0μmol/L、0.125μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L的NVP-BEZ235作用24h后分別有54.07±7.18％、43.47±9.60％、80.17±3.57％、83.2±3.80％、83.2±3.80％、80.03±1.23％KG1a細(xì)胞阻滯在Go/G1期，對(duì)照組與0μmol/L組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0

19、.05)，各組與0μmol/L組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CD34+CD38-KG1a經(jīng)過(guò)0μmol/L、0.125μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L NVP-BEZ235持續(xù)作用24h后與對(duì)照組相比CD34+CD38-KG1a細(xì)胞凋亡率未見(jiàn)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。NVP-BEZ235(0～1μmol/L)直接持續(xù)作用下14d和21d克隆形成數(shù)目分別由375.67±2

20、1.46、706.33±87.31降至0。0.25μmol/L持續(xù)作用下集落數(shù)和集落大小明顯小于對(duì)照組。0.5μmol/L及1μmol/L NVP-BEZ235直接持續(xù)作用下KG1a細(xì)胞集落形成明顯受到抑制，14d及21d集落形成數(shù)目為0個(gè)，倒置顯微鏡下觀察僅見(jiàn)大量碎片未見(jiàn)集落形成。
　　 [小結(jié)]
　　 1.實(shí)驗(yàn)所用KG1a細(xì)胞處于白血病干細(xì)胞發(fā)育水平。
　　 2.不同濃度下的NVP-BEZ235能抑制CD34

21、+CD38-KG1a細(xì)胞的增殖，并具有劑量時(shí)間依賴性。
　　 3.NVP-BEZ235能將CD34+CD38-KG1a髓系白血病干細(xì)胞阻滯在G0/G1期，NVP-BEZ235對(duì)KG1a細(xì)胞的增殖能力的抑制可能與其使KG1a細(xì)胞阻滯在G0/G1期有關(guān)。
　　 4.NVP-BEZ235不能誘導(dǎo)CD34+CD38-KG1a細(xì)胞凋亡。
　　 5.NVP-BEZ235顯著抑制CD34+CD38-KG1a細(xì)胞集落形成能力，對(duì)

22、KG1a細(xì)胞中的具有自我更新和增殖潛能的細(xì)胞具有抑制克隆形成的能力。
　　 第二部分:NVP-BEZ235對(duì)CD34+CD38-髓系白血病干細(xì)胞被活化后外周血單個(gè)核細(xì)胞殺傷的敏感性的影響
　　 [目的]探討NVP-BEZ235對(duì)CD34+CD38-髓系白血病干細(xì)胞被活化后外周血單個(gè)核細(xì)胞殺傷的敏感性的影響及其可能機(jī)制。
　　 [方法]臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)IC50值的NVP-BEZ235對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖的影響。L

23、DH釋放法檢測(cè)在效靶比分別為10∶1、20∶1時(shí)檢測(cè)未經(jīng)過(guò)和經(jīng)過(guò)500u/LIL-2、20ng/ml IL-15活化后的外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)CD34+CD38-KG1a細(xì)胞的殺傷率。流式細(xì)胞儀檢測(cè)NVP-BEZ235作用24后KG1a細(xì)胞表面NKG2D配體的表達(dá)的變化。
　　 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±S）表示。NVP-BEZ235對(duì)PBMC的增殖影響用配對(duì)t檢驗(yàn)。KG1a細(xì)胞和經(jīng)

24、過(guò)NVP-BEZ235作用前后KG1a細(xì)胞被未經(jīng)活化的PBMC及IL-2、IL-15活化的PBMC殺傷的殺傷率用析因設(shè)計(jì)資料方差分析，NVP-BEZ235作用前后KG1a細(xì)胞NKG2D配體的表達(dá)使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]PBMC在0.5μmol/L NVP-BEZ235的作用下與對(duì)照組0μmol/L相比，24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)生長(zhǎng)抑制率分別為0.67±0.29(％)與1.17±0

25、.76(％)、1.67±0.29(％)與1.0±0.5(％)、1.83±0.70(％)與1.83±0.29(％)。各組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。未經(jīng)活化的PBMC在效靶比為10∶1和20∶1時(shí)，KG1a細(xì)胞被其殺傷的殺傷率為4.94±0.54(％)、5.59±0.55(％)二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。KG1a細(xì)胞被經(jīng)過(guò)IL-2、IL-15活化的PBMC在效靶比為10∶1和20∶1時(shí)殺傷率分別為25.73±2.4

26、9(％)、35.05±3.39(％)二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。KG1a細(xì)胞被未經(jīng)活化的PBMC在效靶比為10∶1和20∶1殺傷的殺傷率為4.94±0.54(％)、5.95±0.55(％)。經(jīng)過(guò)0.5μmol/L的NVP-BEZ235作用后KG1a細(xì)胞被PBMC殺傷的殺傷率分別為4.95±1.16(％)、7.00±2.05(％)。KG1a細(xì)胞被PBMC殺傷的敏感性有一定程度的提高，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。經(jīng)IL-

27、2、IL-15活化的PBMC在效靶比為10∶1和20∶1時(shí)，KG1a細(xì)胞被其殺傷的殺傷率為25.73±2.49(％)、35.05±3.39(％)經(jīng)過(guò)0.5μmol/L的NVP-BEZ235作用后，KG1a細(xì)胞被活化后的PBMC殺傷的殺傷率分別為25.61±4.01(％)、47.49±1.65(％)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。NVP-BEZ235持續(xù)作用于KG1a細(xì)胞24小時(shí)后，該細(xì)胞表面NKG2D的配體表達(dá)與NVP-BEZ2

28、35作用前相比較未見(jiàn)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 [小結(jié)]
　　 1.0.5μmol/L的NVP-BEZ235對(duì)PBMC的增殖無(wú)明顯影響;
　　 2.活化后的PBMC殺傷效應(yīng)明顯高于未活化的PBMC細(xì)胞;
　　 3.NVP-BEZ235能增強(qiáng)KG1a細(xì)胞被PBMC的殺傷敏感性。
　　 [結(jié)論]
　　 1.NVP-BEZ235對(duì)髓系白血病干細(xì)胞具有直接的抑制增殖及克隆形