卷曲乳酸桿菌ZJ001 S-層蛋白基因結(jié)構(gòu)及其表達產(chǎn)物的粘附和錨定功能研究.pdf

1、乳酸桿菌是人和動物消化道和生殖道中的正常微生物菌群之一,可通過生物拮抗、改善菌群生態(tài)平衡和提高機體免疫功能等方面在動物生產(chǎn)中發(fā)揮其益生素作用。S-層蛋白(S-layer protein)是許多細菌表面的主要蛋白成分,分子量為40-200 kDa,占菌體總蛋白的10-15％,一般為弱酸性(pI為4-6)。乳酸桿菌S-層蛋白是目前最小的已知S-層蛋白,分子量在25-71 kDa之間,為堿性(pI＞9)。只有少數(shù)乳酸桿菌S-層蛋白的結(jié)構(gòu)已經(jīng)清

2、楚,但大部分功能尚不清楚。國內(nèi)對于乳酸桿菌S-層蛋白基因的表達、蛋白功能及應(yīng)用等方面鮮見報道。本研究通過系列體外試驗探討了豬腸道分離株卷曲乳酸桿菌(Lactobacillus crispatus)ZJ001的益生素樣作用、編碼S-層蛋白的基因結(jié)構(gòu)以及與細菌細胞錨定和宿主細胞粘附功能相關(guān)的S-層蛋白功能域。
　　 L.crispatus ZJ001對強酸和膽汁具有較強的抵抗力,對HeLa細胞的粘附力、對鼠傷寒沙門氏菌(Salmon

3、ella typhimurium)和大腸桿菌(Escherichia coli)O157:H7體外生長和粘附力的拮抗作用與參考菌株ATCC4356相比更強。ZJ001株對S.typhimurium和E coli O157:H7體外生長的抑制作用主要是由于分泌大量乳酸等酸性物質(zhì)導(dǎo)致培養(yǎng)環(huán)境的pH下降所引起。ZJ001株對S.typhimurium和E.coli O157:H7粘附力的拮抗作用則與它的強粘附能力相關(guān),其對HeLa細胞的粘附率

4、為88.9％,顯著高于ATCC4356的15.0％(P＜0.01)。這些結(jié)果表明L.crispatusZJ001可作為益生素菌株而應(yīng)用于預(yù)防腸道疾病。
　　 L.crispatus ZJ001表面存在約42kDa的S-層蛋白,該蛋白可用鹽酸胍和LiCl處理獲得,并對蛋白酶K敏感,細菌連續(xù)傳代不影響該蛋白的表達。利用LiCl除去后,培養(yǎng)8 h左右又能在細菌表面重新形成。LiCl除去S-層蛋白后,ZJ001株的自凝現(xiàn)象和對HeLa細

5、胞的粘附力降低,而抗S-層蛋白多克隆抗體對ZJ001株粘附力的抑制作用進一步證明了S-層蛋白在粘附過程中的重要性。ZJ001株能競爭和排除地抑制S.typhimurium和E.coli O157:H7對HeLa細胞的粘附力,但不能顯著置換已粘附到細胞上的病原菌。LiCl除去S-層蛋白后,ZJ001對病原菌粘附力的拮抗作用降低,對E.coli O157:H7拮抗作用的影響更為明顯。此外,S-層蛋白對E.coli O157:H7粘附力的拮抗

6、作用比對S.typhimurium更強,100μg S-層蛋白對E.coli O157:H7與HeLa細胞的粘附力降低幅度可達87％,但對S.typhimurium的抑制率僅為21.2％。以上結(jié)果表明S-層蛋白參與了L.crispatusZJ001的粘附過程,并能拮抗病原菌的粘附。
　　 L.crispatus ZJ001具有兩個S-層蛋白基因slpA和slpB,這兩個基因編碼的蛋白都具有乳酸桿菌S-層蛋白的典型特征。slpA基

7、因全長1329bp,編碼442個氨基酸殘基,其中N端的30個氨基酸為信號肽序列。slpA成熟蛋白的分子量為44.3kDa,等電點為9.57。slpB基因全長1386bp,編碼461個氨基酸殘基,其中N端30個氨基酸也為信號肽序列。slpB成熟蛋白的分子量為45.1kDa,等電點為9.57。slpA和slpB成熟蛋白的氨基酸組成和含量很相似,疏水性氨基酸、帶電荷的氨基酸和極性氨基酸含量都很高,但都沒有含硫的氨基酸殘基。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明

8、slpA蛋白由37％的α-螺旋和49.7％的β-折疊組成,而slpB由27.9％的α-螺旋和58.9％的β-折疊組成。兩個成熟蛋白的氨基酸同源性為47％,其中C端同源性高達87％,但N端和中間區(qū)域的同源性卻只有30％,與其他乳酸桿菌S-層蛋白的同源性也集中在C端(77-95％之間),N端的變異較大。其中slpA蛋白與L.crispatus JCM5810 CbsA蛋白的同源性最高(82％)。Western blot和間接ELISA結(jié)果表

9、明slpA和slpB之間存在交叉反應(yīng)。與從ZJ001株表面提取的S-層蛋白不同,slpA的E.coli表達產(chǎn)物自身裝配成片狀的類結(jié)晶結(jié)構(gòu),slpB卻形成了圓盤樣結(jié)構(gòu)。盡管slpA和slpB兩個蛋白的結(jié)構(gòu)不同,但均能粘附HeLa細胞。
　　 長距離PCR和序列分析結(jié)果表明slpA和slpB位于長約9.0kb的slp片段上,間隔約為4.5kb。只有slpA基因上游有一啟動子結(jié)構(gòu),而slpB基因為反向序列且上游沒有啟動子結(jié)構(gòu)。RT-P

10、CR、Western blot和間接ELISA結(jié)果進一步證明了只有slpA在L.crispatus ZJ001中得到了轉(zhuǎn)錄和表達,并在細菌表面形成了S-層結(jié)構(gòu)。slpA和slpB基因在5’端存在同源區(qū),slpB基因可能通過位置的互換而轉(zhuǎn)換到slpA啟動子的下游,并且這一現(xiàn)象已在L.acidophilus ATCC4356中得到了證實。L.crispatus ZJ001在需氧和厭氧環(huán)境中形成三種不同的菌落形態(tài),即粗糙型、光滑型和扁平型,但

11、這三種菌落中,都沒有發(fā)現(xiàn)slpA和slpB基因位置顛換的情況,RT-PCR只能檢測到slpA基因的轉(zhuǎn)錄,而SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)這三種不同類型菌落的細菌表面都存在S-層蛋白。以上結(jié)果表明,培養(yǎng)環(huán)境中的氧濃度不能引起slpA和slpB基因位置的顛換,也不能誘導(dǎo)slpB的轉(zhuǎn)錄表達。
　　 根據(jù)氨基酸組成和同源性分析,L.crispatus ZJ001 slpA蛋白具有兩個不同的結(jié)構(gòu)域,即SAN和SAC,其中SAN(1-290aa)

12、由親水性和疏水性氨基酸交替組成,而SAC(291-412aa)主要由親水性氨基酸組成,且堿性氨基酸的含量也很高。為了進一步闡明SAN和SAC的功能,將它們分別和eGFP進行融合表達和純化,結(jié)果表明:SAN-eGFP能和抗S.層蛋白多克隆抗體反應(yīng),并能粘附到HeLa細胞表面:eGFP-SAC與抗S-層蛋白多克隆抗體的反應(yīng)較弱,能錨定到經(jīng)LiCl除去S-層蛋白后的L.crispatus ZJ001和L.acidophilus ATCC435

13、6的細胞外膜上,并能錨定到干酪乳酸桿菌(Lactobacillus casei)M4的細胞壁上,但不能錨定未經(jīng)處理的L.crispatus ZJ001和L.acidophilus ATCC4356以及約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)R20的細胞外膜上。以上結(jié)果表明SAN與slpA蛋白對宿主細胞的粘附作用有關(guān),而SAC主要參與slpA蛋白在L.crispatus ZJ001外膜上的錨定。
　　 本試驗