乳酸桿菌pPG質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)理想表達(dá)條件的探索.pdf

1、相對(duì)于大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)還不夠成熟，主要表現(xiàn)在外源蛋白的表達(dá)量較低、乳酸菌的某些遺傳背景不夠清楚，操作比較繁瑣，表達(dá)條件相對(duì)不夠穩(wěn)定等，因此探索乳酸菌載體系統(tǒng)適宜的表達(dá)條件，提高表達(dá)量，建立乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)的技術(shù)平臺(tái)，對(duì)表達(dá)的外源蛋白更有效的發(fā)揮作用具有重要的實(shí)踐意義。 本試驗(yàn)對(duì)乳酸桿菌pPG質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)理想表達(dá)條件進(jìn)行了探索，以干酪乳桿菌 Lactobacillus casei 393為宿主菌，β-葡萄糖苷酸酶

2、(gusA)基因作為表達(dá)的報(bào)告基因，探索了其表達(dá)過(guò)程中誘導(dǎo)物種類、誘導(dǎo)物濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)方式等各個(gè)影響表達(dá)的關(guān)鍵因素進(jìn)行了研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，活化的種子菌以1％接種于MRS液體培養(yǎng)基，并用1％乳糖為誘導(dǎo)物，初始培養(yǎng)基pH值在6.0～7．0之間，30℃或32℃，靜止培養(yǎng)約7～8小時(shí)，菌液濃度至A<,590>OD達(dá)0.5，表達(dá)效率最高，外源蛋白的表達(dá)量可占菌體總蛋白的14％。分泌表達(dá)載體干酪乳桿菌pPG-2-/L.393上清

3、液分別經(jīng)4℃透析和冷凍干燥濃縮50倍后，West blot未檢測(cè)到目的蛋白，而將pPG-2/L.393的菌體沉淀經(jīng)West blot檢測(cè)后出現(xiàn)明顯的目的帶，由此說(shuō)明干酪乳桿菌pPG-2/L.393表達(dá)的gusA目的蛋白仍結(jié)合在菌體上：培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度對(duì)gusA的表達(dá)有抑制作用。當(dāng)葡萄糖終濃度為0.1％以下時(shí)對(duì)pPG-1/L.393表達(dá)gusA未見(jiàn)明顯影響，而當(dāng)其含量達(dá)到0.5％時(shí)，表達(dá)量明顯下降，至葡萄糖濃度達(dá)到2％時(shí)，基本看不到g