CTC菌株的分類鑒定與S-層基因的表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、本研究?jī)?nèi)容包括兩個(gè)方面，一方面運(yùn)用16S-23SrRNA間隔區(qū)序列比較的方法完成了CTC菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分類，將CTC菌株鑒定為蠟狀芽胞桿菌；另一方面分別將木室克隆的編碼S-層蛋白的基因ctc1和ctc2單獨(dú)或聚合連接到穿梭質(zhì)粒載體pHT304上，可以用于功能分析。 本室分離的CTC菌株，按照現(xiàn)行的表型分類法被巴斯德研究所鑒定為蘇云金芽胞桿菌幕蟲(chóng)亞種，血清型為H2。然而，隨后的研究中表明，CTC菌株雖然可以形成伴胞晶體，但形成的

2、晶體很不穩(wěn)定，而且，其晶體蛋白組成與普通的蘇云金芽胞桿菌不同，并不是由質(zhì)粒攜帶的cry系列的基因編碼，而是染色體上編碼S-層基因的產(chǎn)物，且伴胞晶體蛋白沒(méi)有檢測(cè)到對(duì)昆蟲(chóng)的毒性。因此，我們對(duì)其真實(shí)的屬性和表型分類的可靠性產(chǎn)生了懷疑。運(yùn)用目前國(guó)際系統(tǒng)發(fā)育分類學(xué)上的新熱點(diǎn)技術(shù)——16S-23SrRNA間隔區(qū)序列比較的方法，選擇了一定的菌株組合進(jìn)行測(cè)序，從系統(tǒng)發(fā)育水平上找到CTC菌株的相對(duì)準(zhǔn)確分類學(xué)地位。通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物，PCR擴(kuò)增出組合中7個(gè)候

3、選菌并將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)載體然后進(jìn)行測(cè)序，一方面比較7株菌間的序列差異，同時(shí)通過(guò)檢索核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，收集了其它來(lái)源的序列進(jìn)行聚類分析。其結(jié)果表明，CTC菌株16SrRNA-23SrRNA間隔區(qū)序列與蘇云金芽胞桿菌幕蟲(chóng)亞種代表菌T02的序列同源性在參比菌中最低，明顯不屬于同一類型，與巴斯德研究所運(yùn)用表型分類法的結(jié)果不一致。進(jìn)一步利用23SrRNA的部分序列或編碼S層基因的序列進(jìn)行聚類分析，CTC菌株以及T02菌株在分類的結(jié)果上同來(lái)自其它來(lái)源的

4、蘇云金芽胞桿菌并沒(méi)有完全歸為一處，而是介于蘇云金芽胞桿菌和蠟狀芽胞桿菌之間。因此，結(jié)合目前已經(jīng)證實(shí)該菌株伴胞晶體由S層基因編碼，且對(duì)昆蟲(chóng)無(wú)毒性的特點(diǎn)，我們認(rèn)為CTC菌株屬于蠟狀芽胞桿菌，而且其可能處于蠟狀芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌之間，與伴胞晶體形成的過(guò)渡類型遙相呼應(yīng)，具有重要的研究?jī)r(jià)值。 S-層是位于原核細(xì)胞外殼最外層的一種表膜亞單位結(jié)構(gòu)，呈晶格狀排列，在原核細(xì)胞中分布廣泛。S-層是由完全相同的亞單位組裝成的單分子晶格點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)，

5、它的二維晶格亞單位又是由單一的糖蛋白裝配而成，在結(jié)構(gòu)上有高度的規(guī)則性，代表了一種在進(jìn)化中最簡(jiǎn)單的生物膜的發(fā)生模型。但是人們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)S-層在實(shí)驗(yàn)室適宜的生長(zhǎng)環(huán)境中很容易丟失掉，而在自然界有競(jìng)爭(zhēng)的環(huán)境下則不被丟失。就目前人們的研究結(jié)果來(lái)看，人們對(duì)S-層的統(tǒng)一認(rèn)識(shí)中的一點(diǎn)就是它是存在于細(xì)胞的表面。而本實(shí)驗(yàn)室卻發(fā)現(xiàn)了CTC菌的S-層與眾不同，不僅在其表層有S-層的存在，而且該菌的晶體完全是由S-層蛋白組成。也就是說(shuō)，該菌中的S-層不僅以表膜

6、亞單位的結(jié)構(gòu)存在于細(xì)胞表面而且以晶體的形態(tài)存在于細(xì)胞內(nèi)，而在該菌中也已克隆到兩個(gè)S-層蛋白編碼基因，這兩個(gè)基因與炭疽芽胞桿菌中的兩個(gè)S-層基因有非常高的同源性，但是炭疽芽胞桿菌中的這兩個(gè)基因編碼的S-層蛋白卻是正常形態(tài)存在的。因此具有重要的研究?jī)r(jià)值，為了更好的研究CTC菌株中S層基因的表達(dá)和形成晶體的機(jī)制，本研究克服了實(shí)驗(yàn)中所遇到的特殊困難，分別構(gòu)建了獨(dú)立或聚合的S層基因的穿梭載體，這些構(gòu)建的載體包括，僅含有ctc1基因，僅含有ctc2