中國(guó)毛蝦中流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制活性肽的研究.pdf

1、神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）是流感病毒表面的一種糖蛋白，它能切斷神經(jīng)氨酸殘基與宿主細(xì)胞表面鄰近寡糖之間的α-糖鏈，促使發(fā)育成熟的病毒從寄主細(xì)胞脫落下來(lái)，從而進(jìn)行病毒傳播。目前基于抑制NA活性開發(fā)的的抗流感病毒藥物主要是化學(xué)合成類藥物，如扎那米韋（Zanamivir）和奧司米韋（Oseltamivir）等，從天然產(chǎn)物中得到抑制NA活性物質(zhì)是研究抗流感病毒藥物的新途徑。本文通過原料篩選，最終以中國(guó)毛蝦為目的原料。以體外抑制

2、NA活性和抑制流感病毒感染MDCK細(xì)胞實(shí)驗(yàn)為指標(biāo)，通過葡聚糖凝膠層析、反相高效液相色譜等分離技術(shù)對(duì)中國(guó)毛蝦蛋白酶酶解物分離純化，結(jié)合傅立葉紅外光譜技術(shù)，分析各級(jí)分離純化過程中組分變化，得到具有抑制NA活性的多肽。通過串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定多肽的氨基酸序列。借助計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)SYBYL軟件模擬多肽與NA活性區(qū)域的結(jié)合?；瘜W(xué)法合成多肽，通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、體外抑制感染MDCK細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)、紅細(xì)胞凝集等實(shí)驗(yàn)對(duì)毛蝦多肽的活性效果進(jìn)行了測(cè)定。初步探索了

3、多肽與NA的構(gòu)效關(guān)系。
　　本文的主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　1.選用中國(guó)毛蝦、鳀魚、鰱魚、鱈魚皮等4種不同水產(chǎn)原料，用蛋白酶酶解，通過體外檢測(cè)抑制NA活性和流感病毒感染MDCK細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，最終確定中國(guó)毛蝦為理想原料，通過對(duì)4種原料進(jìn)行氨基酸分析，推測(cè)極性氨基酸含量對(duì)抑制NA活性有一定的影響。接著考察了酶的種類、酶解時(shí)間、加酶量、料液比等因素對(duì)中國(guó)毛蝦水解液體外抑制NA活性的影響。確定酶解中國(guó)毛蝦的最佳條件為：胰蛋白酶酶解、酶解時(shí)

4、間5.5 h，加酶量2000 U/g、料液比1:7（W/V）。在最佳條件下的酶解多肽體外抑制 NA活性的IC50值為1.32 mg/mL。較優(yōu)化條件前的IC50值1.86 mg/mL有所提高。
　　2.以抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶活性為初篩指標(biāo)，利用Sephadex G-15凝膠層析、反相高效液相色譜等分離純化技術(shù)對(duì)中國(guó)毛蝦酶解物進(jìn)行分離純化，得到一條高活性的多肽。測(cè)得體外抑制病毒神經(jīng)氨酸酶活性的IC50值為0.096mmol/L。通

5、過串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)法測(cè)得其氨基酸序列為EISYIHAEAYRRGELK。通過計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)軟件 SYBYL模擬了多肽與神經(jīng)氨酸酶活性區(qū)域的結(jié)合，確定了活性多肽與NA的結(jié)合位點(diǎn)。通過化學(xué)法合成多肽，對(duì)比毛蝦多肽與NA結(jié)合前后紫外光譜的變化，推測(cè)毛蝦多肽與NA活性區(qū)域發(fā)生了有效結(jié)合。
　　3.通過流感病毒侵染MDCK細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，測(cè)定毛蝦多肽對(duì)流感病毒的抑制效果。對(duì)流感病毒的IC50值為0.19 mmol/L。利用MTT法考察了毛蝦多肽對(duì)M