鱈魚皮中流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制活性肽的研究.pdf

1、神經(jīng)氨酸酶（NA）是流感病毒表面重要的糖蛋白，在病毒的復制和傳播過程中起重要作用。流感病毒容易產(chǎn)生變異，而 NA活性位點高度保守，因此以NA為靶點的抗流感病毒藥物成為了當前研究的熱點。目前上市的NA抑制劑有扎那米韋和奧司他韋，而化學合成的藥物成本高，價格貴，容易產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)以及其他的副反應(yīng)，因此尋找天然抗病毒藥物尤為重要。本實驗以低值鱈魚皮膠原蛋白為原料，探討了其酶解液中活性肽的NA抑制活性，優(yōu)化了酶解條件，經(jīng)過分離純化得到了

2、高活性組分，鑒定了其結(jié)構(gòu)，研究了其性質(zhì)，并在細胞水平探討了其抗病毒的作用方式。
　　本文主要研究內(nèi)容如下：
　　1.采用不同的蛋白酶對鱈魚皮膠原蛋白進行酶解，得到了具有流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制活性的酶解物，在9種蛋白酶中篩選出胃蛋白酶為最佳水解用酶，其水解物的IC50值為8.86mg/mL。單因素實驗分別考察了加酶量、底物濃度、酶解時間對酶解反應(yīng)產(chǎn)物抑制活性的影響。利用響應(yīng)面法優(yōu)化了酶解條件，得到了利用鱈魚皮膠原蛋白制備NA抑

3、制活性肽的最佳條件為：加酶量1600U/g，底物濃度22mg/mL，酶解時間6.8h，優(yōu)化條件后的酶解液IC50值為7.95mg/mL（P<0.05）。用10mg/mL的粗酶解液進行細胞實驗，得到的抑制率為66.6％，通過細胞病變抑制實驗初步驗證了酶解液的抗病毒活性。
　　2.利用超濾、Sephadex G-15凝膠柱層析、反相高效液相色譜等技術(shù)對NA抑制粗酶液進行了分離純化，獲得了一條具有NA抑制活性的多肽，鑒定其結(jié)構(gòu)，并對其性

4、質(zhì)進行了研究。得到的氨基酸序列為PGEKGPSGEAGTAGPPGTPGPQGL。采用體外模擬胃腸道消化法，測定了不同階段消化液對NA抑制活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)活性肽不能抵制消化酶的作用，經(jīng)過胃腸蛋白酶水解后，NA抑制活性顯著降低，甚至失活，說明該活性肽不適合經(jīng)口服用，需要考慮其他的途徑攝入。抑制動力學實驗顯示，該活性肽為競爭性抑制劑，抑制常數(shù)Ki為0.29mmol/L。
　　3.在細胞水平上對鱈魚皮膠原蛋白多肽的抗流感病毒活性進行

5、了研究。用MTT法測得NA抑制活性肽的最大無毒濃度為250μg/mL。在被感染的MDCK細胞上，活性肽對流感病毒有一定的抑制活性，一定濃度范圍內(nèi)，抗病毒效果與活性肽濃度成正相關(guān)，其半數(shù)抑制濃度IC50為471μg/mL。
　　以三個不同作用方式（預(yù)處理，吸附同時，吸附后）對病毒進行處理，均有明顯的抗病毒效果，說明活性肽不僅能降低病毒的毒力，而且能影響病毒與宿主細胞的吸附及其進入細胞后的復制和傳播，說明鱈魚皮多肽通過多種方式抗病毒。