鱈魚皮中流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制活性肽的研究.pdf

1、神經(jīng)氨酸酶（NA）是流感病毒表面重要的糖蛋白，在病毒的復(fù)制和傳播過(guò)程中起重要作用。流感病毒容易產(chǎn)生變異，而 NA活性位點(diǎn)高度保守，因此以NA為靶點(diǎn)的抗流感病毒藥物成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。目前上市的NA抑制劑有扎那米韋和奧司他韋，而化學(xué)合成的藥物成本高，價(jià)格貴，容易產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)以及其他的副反應(yīng)，因此尋找天然抗病毒藥物尤為重要。本實(shí)驗(yàn)以低值鱈魚皮膠原蛋白為原料，探討了其酶解液中活性肽的NA抑制活性，優(yōu)化了酶解條件，經(jīng)過(guò)分離純化得到了

2、高活性組分，鑒定了其結(jié)構(gòu)，研究了其性質(zhì)，并在細(xì)胞水平探討了其抗病毒的作用方式。
　　本文主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　1.采用不同的蛋白酶對(duì)鱈魚皮膠原蛋白進(jìn)行酶解，得到了具有流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制活性的酶解物，在9種蛋白酶中篩選出胃蛋白酶為最佳水解用酶，其水解物的IC50值為8.86mg/mL。單因素實(shí)驗(yàn)分別考察了加酶量、底物濃度、酶解時(shí)間對(duì)酶解反應(yīng)產(chǎn)物抑制活性的影響。利用響應(yīng)面法優(yōu)化了酶解條件，得到了利用鱈魚皮膠原蛋白制備NA抑

3、制活性肽的最佳條件為：加酶量1600U/g，底物濃度22mg/mL，酶解時(shí)間6.8h，優(yōu)化條件后的酶解液IC50值為7.95mg/mL（P<0.05）。用10mg/mL的粗酶解液進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，得到的抑制率為66.6％，通過(guò)細(xì)胞病變抑制實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了酶解液的抗病毒活性。
　　2.利用超濾、Sephadex G-15凝膠柱層析、反相高效液相色譜等技術(shù)對(duì)NA抑制粗酶液進(jìn)行了分離純化，獲得了一條具有NA抑制活性的多肽，鑒定其結(jié)構(gòu)，并對(duì)其性

4、質(zhì)進(jìn)行了研究。得到的氨基酸序列為PGEKGPSGEAGTAGPPGTPGPQGL。采用體外模擬胃腸道消化法，測(cè)定了不同階段消化液對(duì)NA抑制活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)活性肽不能抵制消化酶的作用，經(jīng)過(guò)胃腸蛋白酶水解后，NA抑制活性顯著降低，甚至失活，說(shuō)明該活性肽不適合經(jīng)口服用，需要考慮其他的途徑攝入。抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，該活性肽為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，抑制常數(shù)Ki為0.29mmol/L。
　　3.在細(xì)胞水平上對(duì)鱈魚皮膠原蛋白多肽的抗流感病毒活性進(jìn)行

5、了研究。用MTT法測(cè)得NA抑制活性肽的最大無(wú)毒濃度為250μg/mL。在被感染的MDCK細(xì)胞上，活性肽對(duì)流感病毒有一定的抑制活性，一定濃度范圍內(nèi)，抗病毒效果與活性肽濃度成正相關(guān)，其半數(shù)抑制濃度IC50為471μg/mL。
　　以三個(gè)不同作用方式（預(yù)處理，吸附同時(shí)，吸附后）對(duì)病毒進(jìn)行處理，均有明顯的抗病毒效果，說(shuō)明活性肽不僅能降低病毒的毒力，而且能影響病毒與宿主細(xì)胞的吸附及其進(jìn)入細(xì)胞后的復(fù)制和傳播，說(shuō)明鱈魚皮多肽通過(guò)多種方式抗病毒。