以神經(jīng)氨酸酶為靶點的抗流感病毒先導化合物的發(fā)現(xiàn).pdf

1、流感是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染性疾病，嚴重影響了人類的生命健康。近年來，人感染H5N1型高致病性禽流感病例的頻繁出現(xiàn)，新型H1N1病毒開始在世界范圍內(nèi)的傳播，H7N9型禽流感病毒首次引起人類的感染，都一度造成了社會的恐慌，流感已經(jīng)成為了一個全球性的敏感話題。神經(jīng)氨酸酶(NA)是甲型和乙型流感病毒的表面蛋白，在流感病毒的感染和復制過程中發(fā)揮了重要作用，主要表現(xiàn)在:①催化宿主細胞表面受體末端的唾液酸與糖蛋白之間糖苷鍵的裂解，促進新

2、生病毒從感染的細胞中釋出;②阻止子代病毒從宿主細胞釋出后的聚集;③裂解呼吸道黏膜中的唾液酸，阻止病毒滅活并促進病毒在呼吸道中的傳播。雖然甲型流感病毒NA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了10種亞型，但構成其活性中心的氨基酸序列是高度保守的，這使NA成為抗流感病毒藥物設計的一個重要靶點。自從1999年，zanamivir(商品名Relenza)和oseltamivir(商品名Tamiflu)上市以來，NA抑制劑成為抗流感的主要手段，也成為抗流感藥物領域中的研究熱

3、點。隨后，多種結構類型的NA抑制劑相繼被發(fā)現(xiàn)，如苯甲酸類、環(huán)戊烷類、吡咯烷類、多聚體類等。另外兩種高效NA抑制劑peramivir(商品名Rapiacta)和Laninamivir(商品名INAVIR)也已經(jīng)在少數(shù)幾個國家上市。
　　在已獲批準的NA抑制劑中，口服劑oseltamivir是抗流感的首選藥物，在很多國家及地區(qū)被廣泛使用。最近幾年，針對oseltamivir耐藥的病毒株不斷增多，如H5N1型禽流感病毒和多種季節(jié)性H1N

4、1、H3N2型流感病毒株，這使oseltamivir的臨床應用受到一定限制。Zanamivir和peramivir分別通過吸入和靜脈注射方式給藥，雖然使用率低，但也有耐藥病毒株的出現(xiàn)。鑒于目前的抗流感形勢及流感病毒的潛在威脅，開發(fā)新型、高效的NA抑制劑仍具有重要現(xiàn)實意義。
　　本研究論文應用基于受體和配體的合理藥物設計原理與方法，共設計合成了22類，135個化合物，經(jīng)兩種抗病毒模型初步篩選，發(fā)現(xiàn)了兩類具有較好抗流感病毒活性的活性先

5、導化合物。論文共分六個章節(jié)，主要包括三部分內(nèi)容，分述如下:
　　第一部分:通過文獻調(diào)研，我們發(fā)現(xiàn)很多天然產(chǎn)物，如黃酮、查爾酮及其他一些多酚類化合物都能夠較好地抑制流感病毒NA的活性，而且在細胞中還表現(xiàn)出一定的抗流感病毒增殖能力。這些化合物在結構上不符合經(jīng)典NA抑制劑的藥效團特征，與oseltamivir、zanamivir等抑制劑也有很大的差別。為了尋找一類結構新穎的NA抑制劑，在本研究中，我們根據(jù)黃酮類NA抑制劑藥效團模型，以2

6、，4-二氨基為基本結構片段，建立了一個結構多樣性的小分子化合物庫。另外，對具有弱NA抑制活性的咖啡酸進行修飾，合成了3個系列衍生物。通過體外抑酶活性篩選及結構優(yōu)化，共得到92個化合物。其中，只有咖啡酸衍生物具有較高的NA抑制能力，而且在細胞中也表現(xiàn)出一定的抗病毒能力，例如化合物(G3)、(G4)、(M1)、(M2)和(P2)等。進一步的酶抑制動力學研究表明，本研究發(fā)現(xiàn)的咖啡酸衍生物為非競爭性NA抑制劑，這表明這些化合物與經(jīng)典NA抑制劑的

7、作用位點不同，很可能是通過一種新的結合方式對NA發(fā)揮抑制作用的。
　　第二部分:本課題組前期發(fā)現(xiàn)了一些具有中等活性的L-羥脯氨酸衍生物類NA抑制劑，在此基礎上，我們根據(jù)五元環(huán)NA抑制劑的結構特征，繼續(xù)對其進行研究。①將L-羥脯氨酸環(huán)上C-4位的羥基變?yōu)殡一?，在吡咯環(huán)氮原子上引入疏水性基團;②在吡咯環(huán)氮原子上引入脒基，將L-羥脯氨酸環(huán)上C-4位的羥基變?yōu)榘被?，通過對氨基的化學修飾，引入疏水基團;③在吡咯環(huán)氮原子上引入脒基，將L-羥脯

8、氨酸環(huán)上C-4位的羥基變曡氮，利用Click反應引入三氮唑，得到三類新型化合物。體外抑酶試驗顯示，這些L-羥脯氨酸衍生物都只具有較微弱的酶抑制活性，與對照藥(oseltamivircarboxylate)相比有很大的差距。分子對接分析發(fā)現(xiàn)，這些化合物中引入的基團在空間上不能與酶活性中心的相應位點結合，這可能是其活性差的主要原因。
　　第三部分:2006年Nature報道，Group-1的NA(N1，N4，N5和N8)在其活性中心附

9、近有一個較大的150-cavity，該口袋可以作為一個輔助結合位點用于開發(fā)高選擇性的NA抑制劑。根據(jù)這一結構特點，我們以oseltamivir為先導化合物，對其結構中的氨基進行修飾，設計合成了取代的胍基類（T系列）和仲胺類（U系列）兩個系列，共31個化合物，化學結構經(jīng)過1H-NMR、13C-NMR和HRMS確證。經(jīng)查閱文獻證實，所合成的目標化合物均為新型化合物。體外酶抑制活性試驗顯示，本研究合成的oseltamivir衍生物大部分具有N

10、1選擇性，U系列化合物的活性明顯高于T系列?；钚宰詈玫膬蓚€化合物(U12)和(U19)對N1的抑制活性比oseltamivir羧酸鹽提高了8倍。在雞胚試驗中，(U12)也被發(fā)現(xiàn)具有很好的體內(nèi)抗流感病毒活性。通過計算機模擬對接發(fā)現(xiàn)，(U12)中C-5位仲胺氮原子上的聯(lián)苯甲基片段能夠很好地與150-cavity結合，而其它部分則占據(jù)酶活性中心，與晶體結構中oseltamivir羧酸鹽的空間結構大體上重合，這證明150-cavity完全可以作

11、為一個輔助結合區(qū)用于開發(fā)高活性、高選擇性NA抑制劑。
　　結論與總結:本研究利用兩種藥物設計思路分別發(fā)現(xiàn)了兩類新型NA抑制劑，咖啡酸類和oseltamivir衍生物類?？Х人岜旧砭哂卸喾N生物活性，我們基于咖啡酸設計的部分化合物對于流感病毒在酶和細胞水平上都表現(xiàn)出較好的活性，優(yōu)于大部分報道過的活性天然產(chǎn)物?？Х人嵫苌锸且活惾碌腘A抑制劑，值得進一步進行研究。高致病性H5N1型禽流感病毒和H1N1型流感病毒是兩種對人類威脅最大的流