新型流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑的設(shè)計(jì)、合成與初步活性研究.pdf

1、目的：流感是由流感病毒引起的上呼吸道疾病，具有傳染性強(qiáng)、傳播快、潛伏期短、發(fā)病率高的特點(diǎn)，每年影響數(shù)百萬人的健康，并造成比較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)問題。近年來，甲型H5N1高致病性禽流感和H1N1流感在世界范圍內(nèi)的蔓延更加引起了公眾對(duì)流感的關(guān)注，抗流感病毒的藥物研究也因此成為研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。作為基于結(jié)構(gòu)的合理藥物設(shè)計(jì)的成功例子之一的流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑(NAIs)是抗流感病毒藥物研究中取得的重大突破性進(jìn)展。NAIs對(duì)A、B型流感病毒都有效

2、；通過抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶(NA)的活性，阻止子代病毒從宿主細(xì)胞表面釋放而起到控制流感的作用；并且與其它抗流感病毒藥物相比，不易產(chǎn)生抗藥性且耐受性較好。目前上市的NAIs有兩種：葛蘭素公司的zanamivir(GG167，商品名Relenza)和羅氏公司的oseltamivir(GS4104，商品名Tamiflu)另外，由強(qiáng)生和BioCryst公司合作開發(fā)的peramivir(RWJ2270201)，在2009年H1N1大流感中作為緊

3、急授權(quán)藥物應(yīng)用于臨床。流感病毒神經(jīng)氨酸酶(NA)是存在于A、B型流感病毒表面的糖蛋白，在流感病毒復(fù)制和感染過程中起著重要的作用。流感病毒神經(jīng)氨酸酶能催化裂解存在于細(xì)胞表面糖蛋白末端的SA與鄰近寡糖之間的α(2-6)或α(2-3)糖苷鍵，切斷病毒的HA與宿主細(xì)胞之間連接的SA殘基，促進(jìn)子代病毒從感染的細(xì)胞中釋出，并阻止子代病毒從宿主細(xì)胞釋放后的聚集；還可通過裂解呼吸道黏膜中的唾液酸，阻止病毒滅活，從而促進(jìn)病毒在呼吸道的傳播。另外，在所有亞

4、型的甲型和乙型流感病毒表面分布的神經(jīng)氨酸酶的催化中心的附近的一段11個(gè)氨基酸殘基組成的序列高度保守，正是這一特點(diǎn)，使得流感病毒神經(jīng)氨酸酶成為抗流感病毒藥物的一個(gè)很有意義的靶點(diǎn)。已報(bào)道的流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑根據(jù)其母核的結(jié)構(gòu)可以分為唾液酸類、苯甲酸類、環(huán)己烯類、呋喃類、環(huán)戊烷類、吡咯烷類、多聚體類等。本研究的主要目的是以流感病毒神經(jīng)氨酸酶為靶點(diǎn)，借助于計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)和基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)、合成具有新型母核的流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制

5、劑并對(duì)其進(jìn)行活性研究，以發(fā)現(xiàn)具有較好神經(jīng)氨酸酶抑制活性的、結(jié)構(gòu)新穎的先導(dǎo)化合物。
　　 方法：在前期的神經(jīng)氨酸酶抑制活性篩選中，本課題組發(fā)現(xiàn)2-氨基噻唑4-乙酸乙酯和2-苯基-4-噻唑烷酸具有一定的NA抑制活性；另外，鑒于當(dāng)前并沒有噻唑和噻唑烷類衍生物作為神經(jīng)氨酸酶抑制劑的研究或文獻(xiàn)報(bào)道，該研究以這兩個(gè)化合物作為NA抑制劑設(shè)計(jì)、合成的先導(dǎo)化合物，結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，以期望得到NA抑制活性較好的、具有新型母核結(jié)

6、構(gòu)的噻唑或噻唑烷類NAIs作為進(jìn)一步研究的先導(dǎo)化合物。以2-氨基噻唑-4-乙酸乙酯為先導(dǎo)化合物，根據(jù)已知的NA抑制劑與NA活性位點(diǎn)的結(jié)合模型，設(shè)計(jì)一系列噻唑類衍生物作為NA抑制劑：①C-2位的氨基與含有不同疏水側(cè)鏈的Boc保護(hù)的氨基酸的羧基通過酰胺基結(jié)合，Boc保留或者脫除而暴露氨基。②C-4位的羧酸乙酯基團(tuán)保留或者水解成為羧酸。以2-苯基4-噻唑烷酸為先導(dǎo)化合物，設(shè)計(jì)一系列噻唑烷類衍生物作為NA抑制劑：①使用含有不同取代基的苯甲醛與半

7、胱氨酸縮合，得到C-2位不同的噻唑烷類化合物。②C-3位的仲胺基團(tuán)保留或者與氯乙酰氯或苯甲酰氯結(jié)合，希望分別加強(qiáng)與NA活性位點(diǎn)的正電極性區(qū)域或疏水口袋的相互作用；③氯乙?；漠a(chǎn)物通過氨化得到伯胺衍生物。同時(shí)，本研究使用SYBYL軟件將設(shè)計(jì)的噻唑類和噻唑烷類目標(biāo)化合物與NA晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：2HU4)的活性中心區(qū)域進(jìn)行模擬對(duì)接，得到化合物的預(yù)測打分值及化合物與NA活性位點(diǎn)的結(jié)合模型，觀察到化合物與酶的活性中心可以較好的結(jié)合。兩個(gè)系列

8、的目標(biāo)化合物分別以2-氨基-4-乙酸乙酯和L-半胱氨酸為原料合成，原料經(jīng)濟(jì)易得，反應(yīng)路線科學(xué)合理，目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)均經(jīng)過核磁共振氫譜、高分辨質(zhì)譜確證。
　　 結(jié)果：本研究使用流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選試劑盒，篩選了所設(shè)計(jì)、合成的小分子噻唑和噻唑烷類神經(jīng)氨酸酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)所合成的化合物均具有一定程度的神經(jīng)氨酸酶抑制活性。初步的酶活測試結(jié)果顯示，合成的噻唑類和噻唑烷類化合物的NA抑制活性盡管都不及陽性對(duì)照oseltamivir c

9、arboxylate，但與先導(dǎo)化合物相比，大部分都有明顯的提高；其中，噻唑類化合物L(fēng)4d、L5d、L8d和噻唑烷類化合物Y4b、Y4c、Y4f活性較好。另外，本研究利用SYBYL軟件對(duì)合成的化合物進(jìn)行了構(gòu)效關(guān)系研究，探討了兩個(gè)系列化合物與神經(jīng)氨酸酶活性區(qū)域的作用模式；并且采用比較分子力場分析(CoMFA)方法構(gòu)建了噻唑烷類化合物的定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)模型，所構(gòu)建的CoMFA模型具有較好的交叉驗(yàn)證系數(shù)和一定的預(yù)測能力。
　　

10、結(jié)論：綜上所述，本研究選擇流感病毒神經(jīng)氨酸酶作為抗流感病毒藥物的靶點(diǎn)，根據(jù)流感病毒神經(jīng)氨酸酶的三維結(jié)構(gòu)及與其活性位點(diǎn)作用的抑制劑的藥效團(tuán)模型，結(jié)合體外對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制活性的初步篩選，確定2-氨基噻唑4-乙酸乙酯和2-苯基-4-噻唑烷酸作為先導(dǎo)化合物，并利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)進(jìn)行合理藥物設(shè)計(jì)，對(duì)先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，共設(shè)計(jì)、合成了噻唑類和噻唑烷類兩類新型的小分子流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑?；钚越Y(jié)果顯示，所設(shè)計(jì)、合成的兩類化合物均具有一定的