JAK2-STAT通路在人腎小球系膜細胞衰老過程中的作用研究.pdf

1、目的：
　　 腎臟是機體衰老的主要器官,腎小球濾過率(glomerular filtration rate,GFR)隨增齡而降低,進入45歲以后GFR下降速度加快?；陔S著經(jīng)濟發(fā)展老齡人口逐漸增加及老年人是慢性腎臟病高危人群這兩方面因素,在我國逐漸邁入老齡化社會的今天,研究腎臟衰老機制、探討延緩腎臟衰老的方法,顯得尤為重要。腎臟衰老的機制及防治是目前國內(nèi)外學者關(guān)注的重要問題之一。
　　 目前關(guān)于腎臟衰老的機制尚不十分明確

2、。多數(shù)學者認為腎臟衰老主要是由于腎臟固有細胞功能減退所致。腎小球系膜細胞是腎臟的主要固有細胞,其表型和功能改變在腎臟衰老進程中發(fā)揮著重要的作用。目前的研究證實,高糖、血管緊張素Ⅱ(angiotensin,Ang Ⅱ)、叔丁基過氧化氫(tert-butly hydroperoxide,tBHP)可促進細胞衰老。這些研究多見于臍靜脈血管內(nèi)皮細胞、肺成纖維細胞、腹膜間皮細胞、血管平滑肌細胞等,尚沒有對人腎小球系膜細胞(Human Glomer

3、ularMesangial Cell,HGMC)衰老的研究報道。JAK2/STAT通路是一條重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在心肌細胞、巨噬細胞、T細胞等多種細胞的衰老過程中發(fā)揮作用,但其與HGMC衰老之間的關(guān)系尚不清楚。本研究以Ang Ⅱ、tBHP及高糖作為刺激因素,誘導(dǎo)HGMC發(fā)生衰老,檢測衰老HGMC中JAK2/STAT通路活性及STAT蛋白表達的變化,觀察洛沙坦、普羅布考及JAK2阻斷劑AG490對JAK2/STAT通路活性變化及STAT蛋

4、白表達的影響,探討它們在延緩HGMC衰老過程中的作用。
　　 方法：
　　 1、HGMC衰老誘導(dǎo)因素的篩選
　　 (1)用10-8、10-7、10-6、10-5、10-4molL-1Ang Ⅱ刺激HGMC,刺激時間為24h、48 h、72 h、96h；(2)用10、30、50、70、1001μmolL-1 tBHP刺激HGMC,每天1h,連續(xù)5天；(3)用10、20、30、40、50mmolL-1葡萄糖刺激HGM

5、C,刺激時間為24 h、48 h、72 h、96h、120h。(4)對照組細胞在不含任何刺激因素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。HGMC在各因素刺激條件下培養(yǎng),刺激結(jié)束后檢測細胞增殖情況、衰老相關(guān)β半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase,SAβ-gal)染色陽性細胞百分率、細胞周期變化,并將SAβ-gal陽性細胞率及G0-G1期細胞比例達80％作為判定細胞衰老的標準,明確三種因素誘導(dǎo)HGMC發(fā)生衰老的最適

6、濃度和最適培養(yǎng)時間。觀察衰老HGMC形態(tài)學及超微結(jié)構(gòu)改變,進一步判定細胞進入衰老期的最佳刺激因素。
　　 2、HGMC衰老過程中JAK2/STAT通路活性及STAT蛋白表達的變化
　　 采用最佳促進HGMC衰老的刺激因素,誘導(dǎo)HGMC發(fā)生衰老。分組情況
　　 (1)對照組(在不含任何刺激因素的培養(yǎng)液中培養(yǎng))；
　　 (2)衰老組
　　 AngⅡ誘導(dǎo)組(10-6molL-1AngⅡ刺激72h)；

7、r>　　 tBHP誘導(dǎo)組(30μmolL-1tBHP每天刺激1h連續(xù)5天)；
　　 高糖誘導(dǎo)組(30mmolL-1葡萄糖刺激96h)。
　　 應(yīng)用Western Blot及細胞免疫熒光法檢測衰老HGMC內(nèi)STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3的表達變化,研究HGMC衰老過程中JAK2/STAT通路變化及STAT蛋白的表達變化。
　　 3、洛沙坦、普羅布考及AG490對HGMC衰老過程中JAK2/

8、STAT通路活性變化及STAT蛋白表達的影響
　　 將洛沙坦、普羅布考、AG490提前加入HGMC培養(yǎng)液中,并在誘導(dǎo)細胞衰老的環(huán)境中培養(yǎng),通過檢測細胞增殖情況、細胞周期變化、SAβ-gal染色陽性細胞率、細胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)改變及STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3的變化,探討洛沙坦、普羅布考及AG490對HGMC衰老過程中JAK2/STAT通路活性變化及STAT蛋白表達的影響。
　　 (1)AngⅡ作用

9、組
　　 對照組(不含Ang Ⅱ的培養(yǎng)液中培養(yǎng));
　　 Ang Ⅱ誘導(dǎo)衰老組(10-6molL-1Ang Ⅱ)；
　　 洛沙坦(10-5molL-1洛沙坦預(yù)處理)+Ang Ⅱ組;
　　 AG490(10μmolL-1AG490預(yù)處理)+Ang Ⅱ組
　　 (2)tBHP作用組
　　 對照組(不含tBHP的培養(yǎng)液中培養(yǎng))；
　　 tBHP誘導(dǎo)衰老組(30μmolL-1tBHP);<

10、br>　　 普羅布考(40μmolL-1普羅布考預(yù)處理)+tBHP組；
　　 AG490(10μmolL-1AG490預(yù)處理)+tBHP組。
　　 結(jié)論：
　　 1、Ang Ⅱ、tBHP及高糖在體外可以誘導(dǎo)HMGC衰老。10-6molL-1Ang Ⅱ刺激72h、30μmolL-1tBHP每天刺激1h,連續(xù)5天、30mmolL-1葡萄糖刺激96h,是促進HGMC衰老的最佳刺激因素。
　　 2、AngⅡ、t