STAT1在人腎小球系膜細(xì)胞衰老中作用機(jī)制的研究.pdf

1、前言：
　　 腎臟功能隨年齡增長(zhǎng)而下降,衰老是進(jìn)展性腎臟疾病的重要風(fēng)險(xiǎn)之一。隨著年齡的增加,有很大一部分人發(fā)生終末期腎臟病(ESRD),65-70歲間ESRD的發(fā)病率為11%,而在≥75歲的人群中,發(fā)病率則達(dá)到14%。同時(shí),世界人口老齡化問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重,僅僅在1999年到2000年間,65歲的人由950萬(wàn)激增到4.2億,預(yù)計(jì)到2030年,這個(gè)數(shù)字還將翻倍。在中國(guó),60歲以上的人占總?cè)肟诘?1%(1.43億),預(yù)計(jì)到2040年,將

2、增加到24.8%(3.74億),其中≥80歲的人幾乎達(dá)到1億。老年腎臟疾病正逐漸成為影響我們國(guó)民健康和社會(huì)發(fā)展的主要疾病,因此闡明腎臟衰老的分子機(jī)理具有重要的理論和臨床意義。
　　 目前關(guān)于腎臟衰老的機(jī)制尚不十分明確,現(xiàn)認(rèn)為關(guān)鍵細(xì)胞的衰老是器官和組織衰老的病理基礎(chǔ),腎小球系膜細(xì)胞作為腎臟最重要的固有細(xì)胞,其表型和功能的改變?cè)谀I臟衰老進(jìn)程中必然發(fā)揮著重要的作用。因此尋找系膜細(xì)胞衰老的機(jī)制,對(duì)于揭示腎臟衰老的機(jī)制有重要的指導(dǎo)意義。<

3、br>　　 STAT1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的STAT蛋白,在干擾素信號(hào)中發(fā)揮重要作用,主要使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯,促進(jìn)凋亡。在我們先前的研究中已經(jīng)證實(shí),STAT1參與了腎小球系膜細(xì)胞衰老的過(guò)程,但其對(duì)系膜細(xì)胞衰老相關(guān)信號(hào)通路的影響和作用機(jī)制尚不十分清楚,本研究通過(guò)本課題組前期所建立的人腎小球系膜細(xì)胞(HMC)衰老模型即:10-6molL-1血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)刺激72h,150μmolL-1H2O2刺激1h,然后再培養(yǎng)71h,探討STAT1在H

4、MC衰老過(guò)程中的的作用。觀察血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑氯沙坦、抗氧化劑普羅布考及百令膠囊提取液對(duì)HMC衰老及STAT1信號(hào)通路的影響,探討它們?cè)谘泳廐MC衰老過(guò)程中的作用,以期進(jìn)一步探討腎臟衰老的分子機(jī)制及其防治措施。
　　 材料與方法：
　　 一、HMC衰老的誘導(dǎo)和STAT1、p-STATI、STAT3、p-STAT3及p53、p21蛋白的檢測(cè)
　　 采用AngⅡ和H2O2作為誘導(dǎo)HMC衰老的刺激因素建立HMC衰老

5、模型,細(xì)胞同步化后分為:正常對(duì)照組(不含任何刺激因素):AngⅡ組(AngⅡ:10-6molL-1,每24h補(bǔ)充一次,培養(yǎng)72h);H2O2組(H2O2:150μmolL-1刺激1h,然后換為新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)71h)。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期及細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率證實(shí)HMC衰老并用Westernblot法檢測(cè)衰老各組細(xì)胞內(nèi)STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3、p53、p21蛋白的表達(dá)變化。
　　 二、干

6、擾STAT1表達(dá)后,HMC衰老及STAT3、p-STAT3、p53、p21表達(dá)變化
　　 設(shè)計(jì)并合成針對(duì)STAT1基因的三個(gè)特異性siRNA序列,應(yīng)用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將STAT1-siRNA轉(zhuǎn)染入HMC。激光共聚焦顯微鏡鑒定轉(zhuǎn)染效率,應(yīng)用Westernblot、RT-PCR方法篩選最有效抑制STAT1表達(dá)的干擾序列用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染有效干擾序列24h后,分別用上述濃度的AngⅡ和H2O2刺激相應(yīng)時(shí)間,觀

7、察各組細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期、β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率的變化并用Westernblot法檢測(cè)各組細(xì)胞STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3、p53、p21蛋白的表達(dá)變化。
　　 三、氯沙坦、普羅布考、百令膠囊提取液對(duì)HMC衰老及STAT1、p-STAT1、p53、p21變化
　　 將氯沙坦、普羅布考和百令膠囊提取液提前1h加入HMC培養(yǎng)液中,再用AngⅡ或H2O2刺激相應(yīng)時(shí)間,觀察細(xì)胞周期、細(xì)胞β-半乳糖苷酶

8、染色陽(yáng)性率及各組細(xì)胞內(nèi)STAT1、p-STAT1、p53、p21蛋白的表達(dá)變化。
　　 (一)AngⅡ作用組:
　　 實(shí)驗(yàn)分組:正常對(duì)照組;AngⅡ組;AngⅡ+氯沙坦組(氯沙坦:10-5mol-1)AngⅡ+百令組(百令膠囊提取液:50mgL-1)
　　 (二)H2O2作用組:
　　 實(shí)驗(yàn)分組:正常對(duì)照組;H2O2組;H2O2+普羅布考組(普羅布考:40.0umolL-1)。H2O2+百令組(百令膠囊提

9、取液:50mgL-1)
　　 結(jié)果：
　　 一、HMC衰老表型特征和STAT1、P-STAT1、STAT3、P-STAT3及p53、p21蛋白的表達(dá)變化
　　 光鏡下觀察:正常對(duì)照組細(xì)胞呈條梭形生長(zhǎng),排列規(guī)則,細(xì)胞邊界清晰,生命力旺盛。與正常組細(xì)胞相比,AngⅡ和H2O2組細(xì)胞排列不規(guī)則,多型核及雙核細(xì)胞增多,細(xì)胞體積變大,胞漿區(qū)域扁平,其中可見較多顆?；蚩张?。流式細(xì)胞儀分析顯示:正常對(duì)照組細(xì)胞的各期比例正常,G

10、0-G1期細(xì)胞比率為52.32±3.72%,而AngⅡ和H2O2組大部分細(xì)胞停滯于G0-G1期,S期及G2/M期則趨于消失,AngⅡ組G0-G1期細(xì)胞比率為87.3±4.49%,H2O2組G0-G1期細(xì)胞比率為82±2.88%,比正常對(duì)照組明顯增加,差異有顯著性(P＜0.05)。AngⅡ和H2O2組細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率分別為80.63±4.43%和79.84±5.32%,比正常對(duì)照組5.81±1.07%明顯增加,差異有顯著性(P

11、＜0.05)。Westernblot結(jié)果顯示,AngⅡ和H2O2組中STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3及p53和p21表達(dá)均較正常對(duì)照組增加。
　　 二、干擾STAT1表達(dá)后,HMC衰老表型特征和STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3及p53、p21蛋白的表達(dá)變化
　　 HMC轉(zhuǎn)染后48h及72h收集細(xì)胞,分別用RT-PCR和Westernblot方法檢測(cè)干擾效率,STAT1mRNA水

12、平降低約67%,蛋白水平也明顯降低,證實(shí)干擾成功,同時(shí)用陰性對(duì)照證實(shí)干擾的特異性。
　　 AngⅡ組中和AngⅡ+STAT1-siRNA組中β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率分別為80.63±4.43%和32.66±4.63%,AngⅡ+STAT1-siRNA組中G0-G1期細(xì)胞比率比AngⅡ組明顯降低(62.63±4.96%vs87.3±4.49%)。
　　 H2O2組和H2O2+STAT1-siRNA組中β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性

13、率分別為79.84±5.32%和27.96±6.49%,H2O2+STAT1-siRNA組中G0-G1期細(xì)胞比率與H2O2組分別為63.96±5.8%和82±2.88%。
　　 AngⅡ+STAT1-siRNA組和H2O2+STAT1-siRNA組中p53、p21表達(dá)分別比AngⅡ和H2O2組明顯降低,而STAT3及p-STAT3的變化卻較之反而升高。
　　 三、普羅布考、氯沙坦、百令膠囊提取液對(duì)HMC衰老及STAT1、

14、p-STAT1、p53、p21蛋白表達(dá)的影響
　　 AngⅡ+氯沙坦組、AngⅡ+百令膠囊提取液組和AngⅡ組中β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率分別為47.91±9.34%、40.87±9.49%和84.89±6.01%。氯沙坦和百令干預(yù)后G0=G1期細(xì)胞比率比AngⅡ組明顯降低,分別是62.75±3.97%、64.77±5.21%和88.92±4.86%。STAT1、p-STAT1、p53、p21表達(dá)降低,氯沙坦組更明顯。
　　

15、 H2O2+普羅布考組、H2O2+百令膠囊提取液組和H2O2組中β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率分別為47.28±4.53%、55.26±5.20%和76.99±6.15%。G0-G1期細(xì)胞比率比H2O2組明顯降低,分別是61.48±2.48%、64.53±4.96和82.07±3.69%。STAT1、p-STAT1、p53、p21表達(dá)降低,普羅布考組更明顯。
　　 結(jié)論：
　　 1、在系膜細(xì)胞衰老過(guò)程中STAT1、p-STA

16、T1表達(dá)增多。伴隨STAT1活性增強(qiáng),STAT3、p-STAT3、p53、p21表達(dá)升高。
　　 2、轉(zhuǎn)染STAT1-siRNA,干擾STAT1表達(dá)后,系膜細(xì)胞衰老減輕,STAT3、p-STAT3表達(dá)升高,p53、p21降低。提示STAT1可能直接通過(guò)p53/p21通路調(diào)控系膜細(xì)胞衰老過(guò)程;同時(shí)也提示在調(diào)控系膜細(xì)胞衰老過(guò)程中STAT1和STAT3發(fā)揮相互制約作用。
　　 3、氯沙坦、普羅布考和百令膠囊提取液可以通過(guò)調(diào)控S