p102在高糖激活腎臟系膜細(xì)胞及腎小球RAS中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常見的慢性并發(fā)癥之一。近年來，隨著生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變，DM的患病率逐漸升高，DN的發(fā)病率也隨之升高。DN是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥之一，而腎小球是DN的主要病變部位之一。DN早期出現(xiàn)腎臟體積增大，腎小球血流量和濾過率增加，進(jìn)而出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)增加，腎小球基底膜肥厚，腎小球

2、囊和腎小球系膜細(xì)胞呈結(jié)節(jié)性增生和肥厚，引起腎小球硬化和功能喪失，隨著病程延長，出現(xiàn)慢性腎功能不全、尿毒癥。腎功能衰竭是糖尿病患者的主要死亡原因之一。
　　DN是由不同的病因與發(fā)病機(jī)制引起的，目前認(rèn)為是高血糖、高血壓、腎臟血流動力學(xué)異常及遺傳背景等多因素共同作用的結(jié)果，但具體機(jī)制仍不清楚。腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)主要調(diào)節(jié)人體血壓、水分、電解質(zhì)平衡，以保持人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性。在腎臟

3、組織中存在完整的局部RAS，腎臟局部RAS在腎臟功能的調(diào)節(jié)和組織重構(gòu)中的作用尤為重要。RAS的過度激活也是DN發(fā)病的關(guān)鍵因素之一，抑制RAS的過度激活后，可以明顯改善腎功能。RAS的兩類抑制劑，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)和血管緊張素受體抑制劑(angiotensinreceptor blockers，ARBs)可以明顯延緩DN患者腎臟功能減退的進(jìn)程

4、，也是現(xiàn)在臨床上治療DN較常見的兩類藥。
　　許多研究證實(shí)，在高糖狀態(tài)下，腎臟組織活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成增加是導(dǎo)致糖尿病腎損害的重要原因。糖尿病早期，高糖環(huán)境刺激細(xì)胞NADPH氧化酶，引起ROS明顯升高。ROS與RAS系統(tǒng)又相互作用，共同促進(jìn)腎臟損傷，但兩者相互作用的機(jī)制至今并不清楚。
　　p100(SND1)蛋白于1995年首次被Tong(X)等人鑒定為轉(zhuǎn)錄激活因子，近幾年被證

5、實(shí)通過多種方式參與基因轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控。p100是一種多功能蛋白，它作為轉(zhuǎn)錄激活因子可以與EBNA-2、STAT5、STAT6、c-Myb等多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白相互作用，增強(qiáng)它們所調(diào)控的轉(zhuǎn)錄;它還是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)的成分，參與mRNA的剪切、降解和成熟。有文獻(xiàn)報(bào)道p100與癌癥的發(fā)生有關(guān);也有人認(rèn)為p100可以作為癌癥的指標(biāo);p100還可與AT1R的3'-UTR結(jié)合，

6、減少AT1R mRNA的降解，增加它的翻譯。p100是一個(gè)相當(dāng)保守的蛋白，大鼠p102是人p100的同源性蛋白，是一個(gè)與p100有著相似功能的轉(zhuǎn)錄激活因子，由此我們推測，大鼠p102可能也參與AT1R的表達(dá)調(diào)控。腎臟是RAS在體內(nèi)發(fā)揮作用的重要靶器官之一，已公認(rèn)RAS功能異常參與了糖尿病腎損害的發(fā)生與發(fā)展，那么，在糖尿病時(shí)，RAS功能異常是否與p102有關(guān)，p102是否參與DN發(fā)生和發(fā)展？
　　為此，本實(shí)驗(yàn)的研究目的是:在SD大鼠

7、中探討p102在腎小球中的表達(dá)情況;研究在高糖狀態(tài)下p102表達(dá)的改變及原因;高糖狀態(tài)下RAS的改變是否受到p102的調(diào)控。通過上述研究，試圖闡明p102在DN中作用以及機(jī)制。
　　課題研究由以下兩部分組成:
　　一、p102在高糖激活系膜細(xì)胞RAS中的作用及機(jī)制研究
　　1、在離體培養(yǎng)的大鼠腎臟系膜細(xì)胞上觀察了高糖(HG,25 mmol/L D-葡萄糖)對ROS的影響。系膜細(xì)胞給予高糖刺激1h后，ROS便出現(xiàn)明顯升高

8、，ROS的升高狀態(tài)一直持續(xù)到48 h，在24 h時(shí)達(dá)到高峰。NADPH氧化酶抑制劑DPI(Diphenylene-chloride iodonium，10-6 mol/L)可以抑制高糖引起的ROS升高，這證實(shí)高糖可以通過NADPH氧化酶途徑引起ROS的升高。
　　2、通過Western blot與RT-PCR技術(shù)證實(shí)了p102在大鼠腎臟系膜細(xì)胞中有表達(dá)，高糖可以引起p102表達(dá)明顯增加，DPI(10-6 mol/L)不僅可以完全抑

9、制p102的升高，還明顯降低了正常培養(yǎng)的腎臟系膜細(xì)胞中p102的表達(dá)，由于DPI主要的效應(yīng)是降低ROS的水平，這提示在高糖狀態(tài)下，p102的表達(dá)受ROS的影響。同時(shí)，DPI(10-6 mol/L)也能抑制高糖引起的TGF-β1和fibronectin的表達(dá)增加，提示TGF-β1和fibronectin的表達(dá)也受ROS的影響。
　　3、高糖刺激能明顯升高系膜細(xì)胞p102的表達(dá)，系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA(50 nM)抑制p102表達(dá)后，

10、分別于24 h、48h時(shí)間點(diǎn)觀察到高糖引起的p102表達(dá)水平升高被明顯抑制，同時(shí)，高糖刺激引起的系膜細(xì)胞中血管緊張素原(angiotensinigen，AGT)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)、血管緊張素Ⅱ-1型受體(angiotensinⅡ type1 receptor，AT1R) mRNA和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-

11、β1)、fibronectin蛋白表達(dá)增加也被p102siRNA(50 nM)完全抑制。提示系膜細(xì)胞中RAS多個(gè)成員的表達(dá)受到p102的調(diào)控。
　　4、為了確定p102與AT1R之間的相互關(guān)系，提前30 min給予系膜細(xì)胞AT1R抑制劑Candesartan(10-6 mol/L)，再給予高糖刺激。Candesartan能明顯抑制高糖刺激引起的系膜細(xì)胞中TGF-β1和fibronectin的蛋白增加，卻對p102的表達(dá)沒有明顯影響

12、，證實(shí)高糖通過AT1R引起TGF-β1和fibronectin的表達(dá)升高，而p102并不受AT1R的調(diào)控，結(jié)合前面的結(jié)果提示p102位于AT1R的上游，調(diào)控AT1R的表達(dá)。
　　在腎臟系膜細(xì)胞上研究得到的結(jié)果證實(shí)高糖可以通過NADPH氧化酶引起ROS的升高，ROS的升高刺激了p102的表達(dá)，p102升高后通過增加RAS中多個(gè)成員的表達(dá)水平，使局部RAS功能增強(qiáng)，再通過RAS間接調(diào)控TGF-β1與fibronectin的表達(dá)。

13、>　　二、高糖對大鼠腎小球局部RAS表達(dá)的影響及機(jī)制研究
　　1、從正常SD大鼠腎臟皮質(zhì)中分離腎小球，在離體培養(yǎng)條件下，給予高糖(HG,25 mmol/L D-葡萄糖)刺激后觀察腎小球中ROS的變化。ROS從給予高糖刺激0.5 h時(shí)出現(xiàn)明顯升高，并保持在較高水平，一直持續(xù)到24 h，在3h時(shí)達(dá)到高峰。提前30 min對腎小球給予DPI(10-6 mol/L)孵育后，能明顯抑制高糖引起的ROS升高，這一結(jié)果與系膜細(xì)胞上觀察到的ROS

14、變化相符，進(jìn)一步說明高糖可以通過NADPH氧化酶途徑引起ROS的升高。
　　2、Western blot與RT-PCR檢測方法均證實(shí)p102在腎小球中有表達(dá)，而且高糖可以誘導(dǎo)腎小球中p102的表達(dá)增加。DPI(10-6 mol/L)不僅可以完全抑制p102的升高，還降低了正常培養(yǎng)的腎小球中p102的水平，這一結(jié)果也是與系膜細(xì)胞上的變化相一致，這表明高糖刺激可通過ROS引起p102的增加。
　　3、腎小球在高糖中培養(yǎng)48 h后

15、，ACE、AT1R mRNA都出現(xiàn)明顯的升高，DPI(10-6 mol/L)可以完全抑制高糖刺激引起的ACE、AT1R mRNA水平升高，說明在高糖刺激后，ROS水平的升高可以進(jìn)一步激活腎小球局部RAS。
　　這部分實(shí)驗(yàn)說明p102在腎小球中有表達(dá)。在高糖刺激早期，ROS便出現(xiàn)迅速的升高，ROS的升高引起p102表達(dá)增加;此外，腎小球中ACE、AT1R mRNA水平在高糖刺激48 h后出現(xiàn)明顯的升高，ACE、AT1R mRNA水平