乙型肝炎病毒對人腎小球系膜細胞凋亡的影響.pdf

1、研究目的：
　　 通過將PHY106-CHBV質(zhì)粒（含C基因型HBV的全基因組）轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的正常人腎小球系膜細胞(NHMC)，研究乙型肝炎病毒(HBV)在NHMC細胞內(nèi)的表達和對細胞凋亡的影響及淋巴細胞對表達乙肝標志物的NHMC細胞凋亡的影響。初步探討乙型肝炎病毒在乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎(HBV-GN)腎損傷中的作用機制。
　　 方法：
　　 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將C基因型重組全長乙型肝炎病毒(PHY106-CH

2、BV)轉(zhuǎn)染至人腎小球系膜細胞(NHMC)。收集24、48和72h細胞培養(yǎng)上清液，進行HBsAg與HBeAg的定量檢測；應用倒置顯微鏡和熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化。MTT法檢測NHMC細胞增殖率。流式細胞儀檢測NHMC細胞凋亡率。半定量RT-PCR檢測Bax、Bcl-2mRNA在NHMC細胞內(nèi)的表達情況。Caspase-3酶活性檢測試劑盒檢測NHMC細胞內(nèi)Caspase-3酶的活性。將人外周血淋巴細胞與各組NHMC細胞共培養(yǎng)，收集48h

3、培養(yǎng)上清液進行HBsAg與HBeAg的定性檢測。MTT法檢測與人外周血淋巴細胞共培養(yǎng)的NHMC細胞的增殖率。流式細胞儀檢測共培養(yǎng)NHMC細胞的凋亡率。
　　 結(jié)果：
　　 轉(zhuǎn)染PHY106-CHBV的NHMC細胞培養(yǎng)上清液中可檢測到HBsAg和HBeAg的高表達。轉(zhuǎn)染PHY106-CHBV48h后可誘導人腎小球系膜細胞形態(tài)學發(fā)生變化，表現(xiàn)為細胞皺縮、聚集，細胞稀疏，呈放射狀，細胞核出現(xiàn)大小不等的凋亡小體。MTT結(jié)果顯示實

4、驗組細胞增殖受抑；流式細胞儀檢測顯示實驗組細胞凋亡率(5.84±1.70)％與正常對照組(1.09±0.55)％及陰性對照組(1.58±0.67)％比較明顯增加（P＜0.01）；半定量RT-PCR檢測結(jié)果示實驗組中Bax mRNA的表達比值為(0.32±0.02)，高于空白對照組(0.22±0.02)及陰性對照組(0.25±0.02)，其差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；Bcl-2mRNA的表達比值在實驗組為(0.77±0.03)、空白

5、對照組為(0.75±0.03)、陰性對照組為(0.75±0.01)，其差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；Caspase-3酶活性檢測顯示轉(zhuǎn)染PHY106-CHBV后可活化Caspase-3，其差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。NHMC細胞與人外周血淋巴細胞共培養(yǎng)后，實驗組細胞培養(yǎng)上清液中可檢測到HBsAg和HBeAg的高表達。MTT結(jié)果顯示NHMC細胞增殖受抑制。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示NHMC細胞凋亡率增加。實驗組細胞凋亡率(5.35