甲基雙加氧酶2在高糖刺激腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1表達(dá)中的作用研究.pdf

1、糖尿病腎病(DN)是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，目前研究發(fā)現(xiàn)有大約40％以上的糖尿病患者同時(shí)患有糖尿病腎病，它同時(shí)也是引起終末期腎功能衰竭(ESRF)最主要的病因。大量國(guó)內(nèi)外的研究提示，高血糖可以通過(guò)多種途徑和機(jī)制導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。近年來(lái)，表觀遺傳學(xué)逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，即在不改變DNA序列的前提下發(fā)生的可遺傳和逆轉(zhuǎn)的改變。表觀遺傳學(xué)的理論能夠解釋高血糖對(duì)糖尿病并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)的持續(xù)性效果，目前這種現(xiàn)象被稱為“代謝記憶”現(xiàn)象。 DNA甲基

2、化作為表觀遺傳學(xué)的重要機(jī)制之一，在基因表觀遺傳修飾及表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，其中甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)家族(DNMT1、3A、3B)參與DNA的被動(dòng)去甲基化，而甲基雙加氧酶(TETs)家族(TET1、TET2、TET3)參與DNA的主動(dòng)去甲基化。
　　目的：
　　本文擬通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察在高糖刺激下人腎小球系膜細(xì)胞(HMCs)，DNA甲基化相關(guān)酶類(lèi)甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1、3A、3B)、甲基雙加氧酶(TET1～3)的表達(dá)變化

3、，然后通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)分別觀察甲基雙加氧酶TET2與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)表達(dá)變化及其CpG島的甲基化狀態(tài)的相互關(guān)系，還包括系膜細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化相關(guān)分子α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和細(xì)胞增殖情況。隨后，通過(guò)shRNA特異性干擾人腎小球系膜細(xì)胞TET2的表達(dá)，及通過(guò)(多聚ADP核糖聚合酶)PARP抑制劑PJ-34飼喂db/db小鼠抑制TET2的表達(dá)觀察相應(yīng)TGF-β1表達(dá)變化及其CpG島的甲基化狀態(tài)以及系膜細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化相關(guān)分子

4、α-SMA和細(xì)胞增殖情況，從而探討TET2在高糖誘導(dǎo)TGF-β1表達(dá)激活及高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的作用。
　　方法：
　　1.將體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞(HMCs)按照培養(yǎng)基的葡萄糖濃度隨機(jī)分為五組:低糖正常對(duì)照組(NG，5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖組（HG，30 mmol/L葡萄糖），其中高糖組分別培養(yǎng)12h-72h:高糖12h組(HG-12h)、高糖24h組(HG-24h)、高糖48h組(HG-48h、高糖7

5、2h組(HG-72h)。
　　2.通過(guò)shRNA干擾高糖培養(yǎng)下TET2在系膜細(xì)胞中的表達(dá)，分為空白對(duì)照組(controlB)、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組(control M)、陰性對(duì)照組(control N)、shRNA干擾組(shRNA)。
　　3.雌性C57BLKS/J小鼠共20只，其中7周齡db/db小鼠5只、11周齡db/db小鼠及db/m小鼠各5只、15周齡db/db小鼠5只。分別適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，隨后進(jìn)行試驗(yàn)，分為4組，每組5

6、只小鼠:db/m組:12周齡db/m小鼠、db/db-8w組:8周齡db/db小鼠、db/db-12w組:12周齡db/db小鼠、db/db-16w組:16周齡db/db小鼠。
　　4.4周齡雌性C57BLKS/J小鼠共15只，其中db/db小鼠10只，db/m小鼠5只;分別適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，隨后進(jìn)行試驗(yàn)，其中db/db小鼠以完全隨機(jī)的方法分別分為:db/db對(duì)照組和db/db+PJ-34組。將PARP抑制劑PJ-34用蒸餾水溶解至

7、2.4 g/l，并加適量阿斯巴甜便于飼喂，以每天每公斤體重30mg的量定時(shí)飼喂db/db+PJ-34組，其余db/m對(duì)照組和db/db對(duì)照組以等量含阿巴斯甜的蒸餾水飼喂至16周齡。
　　5.分別通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting檢測(cè)TGF-β1、DNMT1、3A、3B、TET1～3和α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)。
　　6.通過(guò)亞硫酸氫鈉測(cè)序法(BSP)檢測(cè)TGF-β1基因CpG島的甲基化狀態(tài)。

8、　　7.腎小球系膜細(xì)胞增殖通過(guò)噻唑藍(lán)比色法(MTT)檢測(cè)。
　　8.通過(guò)免疫組化檢測(cè)小鼠腎臟皮質(zhì)中α-SMA的表達(dá)變化。
　　9.通過(guò)(過(guò)碘酸雪夫染色)PAS染色觀察小鼠腎臟皮質(zhì)中腎小球的病理變化。
　　結(jié)果：
　　1.高糖刺激培養(yǎng)人系膜細(xì)胞TGF-β1表達(dá)上調(diào)，同時(shí)誘導(dǎo)TGF-β1基因CpG島出現(xiàn)去甲基化改變。
　　用高糖培養(yǎng)人系膜細(xì)胞，觀察TGF-β1表達(dá)變化、TGFβ基因表達(dá)調(diào)控區(qū)甲基化變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)

9、，與對(duì)照組相比較，高糖培養(yǎng)24h后，系膜細(xì)胞TGF-β1的mRNA及蛋白表達(dá)均顯著增加，并存在時(shí)間依賴效應(yīng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，高糖培養(yǎng)24h后系膜細(xì)胞TGF-β1第一外顯子區(qū)CpG島的四個(gè)CG位點(diǎn)出現(xiàn)明顯的去甲基化改變。
　　2.高糖培養(yǎng)可誘導(dǎo)人系膜細(xì)胞TET2表達(dá)上調(diào)。
　　我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，高糖培養(yǎng)12h后，參與主動(dòng)去甲基化的TET2出現(xiàn)明顯的表達(dá)上調(diào)，且存在時(shí)間依賴效應(yīng)，這與高糖誘導(dǎo)TGF-β1基

10、因CpG島去甲基化改變相一致。TET1、TET3以及DNMT1、DNMT3A表達(dá)未見(jiàn)明顯改變。
　　3.應(yīng)用shRNA特異性干擾TET2的表達(dá)，可逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的人系膜細(xì)胞TGF-β1基因CpG島所發(fā)生的去甲基化及其高表達(dá)。
　　與對(duì)照組比較，shRNA可顯著抑制一般培養(yǎng)條件下系膜細(xì)胞TET2的mRNA及蛋白表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，shRNA也可顯著下調(diào)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞TGF-β1的基因及蛋白表達(dá)。甲基化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，shRNA處理后，

11、高糖誘導(dǎo)的TGF-β1基因調(diào)控區(qū)CpG島去甲基化可被顯著逆轉(zhuǎn)。
　　4.進(jìn)一步研究證實(shí)，應(yīng)用shRNA特異性干擾TET2的表達(dá)后，高糖誘導(dǎo)下的系膜細(xì)胞α-SMA表達(dá)升高和系膜細(xì)胞的顯著增殖也被抑制。
　　5.隨著db/db小鼠糖尿病腎病的發(fā)生和進(jìn)展，腎皮質(zhì)中TET2和TGFβ1的表達(dá)水平均逐步升高，TGF-β1基因調(diào)控區(qū)CpG島出現(xiàn)明顯的去甲基化改變。
　　我們進(jìn)一步觀察了不同周齡的db/db小鼠腎臟皮質(zhì)中TGF-β1

12、的表達(dá)改變發(fā)現(xiàn):與db/m對(duì)照組小鼠比較，腎臟皮質(zhì)TGF-β1的mRNA及蛋白表達(dá)均出現(xiàn)明顯地進(jìn)行性上調(diào)。BSP測(cè)序發(fā)現(xiàn)，與db/m對(duì)照組比較，從8周齡到16周齡的db/db小鼠，TGF-β1啟動(dòng)子區(qū)及第一外顯子區(qū)的四個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)持續(xù)的去甲基化改變。為此，我們進(jìn)一步研究了DNA甲基化相關(guān)酶在db/db小鼠腎臟皮質(zhì)中的表達(dá)變化，我們發(fā)現(xiàn):與db/m對(duì)照組比較，隨著周齡的增長(zhǎng)，腎臟皮質(zhì)TET2及DNMT3B的mRNA及蛋白表達(dá)均出現(xiàn)明顯地上調(diào)

13、，但TET1、TET3、DNMT1、DNMT3A未見(jiàn)明顯表達(dá)改變。
　　6.PJ-34抑制TET2的表達(dá)，不僅使db/db小鼠腎皮質(zhì)TGFβ1基因調(diào)控區(qū)CpG島去甲基化被逆轉(zhuǎn)，也使TGF-β1基因表達(dá)水平下調(diào)。
　　為了進(jìn)一步證明在體情況下TET2-TGFβ基因調(diào)控區(qū)CpG島甲基化變化-TGFβ表達(dá)變化三者之間的調(diào)控關(guān)系，我們應(yīng)用PARP抑制劑PJ-34飼喂抑制TET2的表達(dá)后，與db/db對(duì)照組比較，發(fā)現(xiàn)db/db+PJ-

14、34組TGFβ1啟動(dòng)子區(qū)及第一外顯子區(qū)上四個(gè)位點(diǎn)的甲基化率明顯升高，與此同時(shí)，TGF-β1的mRNA及蛋白表達(dá)也出現(xiàn)明顯地下調(diào)。
　　7.抑制db/db小鼠腎皮質(zhì)中TET2的表達(dá)后，db/db小鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖及α-SMA的合成也被顯著抑制。
　　我們通過(guò)PAS染色觀察腎臟的病理改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與db/db對(duì)照組相比較，db/db+PJ-34組腎小球肥大、系膜基質(zhì)、系膜區(qū)面積、毛細(xì)血管基底膜厚度等病理改變均明顯減輕。通過(guò)