產甲基丙二酰輔酶A的假單孢菌菌株和德胺糖表達載體的構建.pdf

1、聚酮化合物是一大類結構多樣性的天然產物，并廣泛應用于治療學，很多聚酮化合物需要以甲基丙二酰輔酶A(mm-CoA)作為整合C3單元的延伸單位。mm-CoA可以通過兩條途徑合成：PCC(丙?；鵆oA羧化酶)途徑，該途徑由兩個基因：accA1和pccB組成，accA1基因編碼丙?；o酶A羧化酶的α亞單元，pccB基因編碼羧基轉移酶亞單元；MCM途徑，MCM基因簇由三個開放閱讀框組成，即mm-CoA變位酶(MCM基因)、差向異構酶(epi基因)

2、和ArgK共同完成。 用PCR的方法克隆MCM基因簇，從Escherichia coli(大腸桿菌)中擴增mm-CoA變位酶基因和ArgK基因，從Streptomyces coelicolor A3(2)(天藍色鏈霉菌)中擴增差向異構酶基因；同時從Pseudomonas putida KT2440(惡臭假單胞菌)中擴增兩段同源區(qū)域：left基因和right基因(1eft基因位于gph基因左側，包含rpe基因，長度為1kb；rig

3、ht基因位于gph基因右側，是trpE基因的一部分，長度為1.0kb);以pACYC177為模板擴增卡那霉素抗性基因(Kan抗性基因)，長度為1.0kb，以上六個基因，頹序為：left-kan-epi-mcm-argK-right，這樣MCM基因簇處于Kan抗性基因啟動子的驅動，將所構建的基因盒克隆到P.putida KT2440轉化載體pEX100TLinK。該載體含有蔗糖敏感型負篩選標記SacB基因，當含有MCM基因簇的質粒通過結合

4、轉移的方法異源表達到P.putida KT2440，同源區(qū)域兩端發(fā)生雙交換，MCM基因簇被整合到P. putida KT2440基因組DNA，同時也有發(fā)生單交換的情況，單交換的菌株pEX100TLinK也被整合到P.putida KT2440基因組DNA中，由于SacB基因的存在，單交換的菌株不能在含有蔗糖的培養(yǎng)基中生長，因此，結合轉移后轉化子經蔗糖篩選后長出的多數是雙交換的菌株。 PCC基因簇由兩個基因組成：accA1和pec

5、B。aeeA1基因和pecB基因都來源于S.coelicolor。用同樣的方法克隆抗性基因和同源區(qū)域，共五個基因，順序為：left-kan-aeeA1-pceB-right，克隆到p. putida KT2440中轉化載體pEX100TLinK，同樣方法篩選轉化子并驗證。 MCM基因簇和PCC基因簇異源表達到P.putida KT2440中。對于已知基因簇異源表達可以選擇E.coil，S.lividans、P.putida、B.subt

6、ilis，很明顯每個系統(tǒng)都有其局限性，因此高效的表達一般都發(fā)生在與基因簇相近的微生物。放線菌及相關的鏈霉菌是被應用最廣泛的異源表達體系，因為它們能提供聚酮化合物生物合成全部的裝置，而且多數已知的次級代謝產物生物合成基因簇都源自該屬。大腸桿菌也是頗受歡迎的異源表達體系，因為它是目前遺傳學上的工具、有成熟的發(fā)酵方面知識、易于操作，但是它也有很多缺點，如與多數生物合成基因簇比有不同的G+C含量。在放線菌和E.coli間的差距可以由P.puti

7、da來彌補，P.putida產生的PKS/NRPS雜環(huán)分子是天然產生的五倍，發(fā)酵時間卻縮短了三倍。P.putida擁有E.coli的優(yōu)勢，如易于操作、遺傳學工其、可比的生長率；也有放線菌的特性，像高的G+C含量、能產生次級代謝產物。 MCM基因簇和PCC基因簇異源表達的重組菌株通過GC/MC的方法進行分析。甲基丙二酸鹽及其CoA酯和丁醇反應后生成甲基丙二酸的二丁基酯(mmdiBE)，mmdiBE通過GC/MS定量分析。

8、　　格爾德霉素(Geldanamyein，GA)是一種苯醌安莎類抗生素，它和ATP競爭結合熱休克蛋白Hsp90的ATP結合位點，影響Hsp90的功能。從藥效角度來看，在幾種入類癌癥中，Hsp90介導的蛋自在信號轉導和轉錄中有重要作用，這種治療靶點還沒有被運用。因此引起人們研究GA的極大地興趣，并將GA及其類似物列為潛在的抗癌藥物。但其具有較強的肝毒性，而且水溶性也不好，在有機溶劑溶解狀態(tài)下穩(wěn)定性差，且見光易分解，對熱、酸、堿均不穩(wěn)定，所

9、以需要對其結構進行相應改造，尋找毒性和活性更好的衍生物。 對GA的結構改造主要通過生物學方法和化學方法，通過生物學方法改造化合物的結構，尤其特殊的優(yōu)勢；首先，通過生物學方法可以實現化學反應難以進行的反應；其次，可以實現對化合物多位點的改造，產生多種衍生物；最后，生物學方法獲得基因工程菌進行發(fā)酵、提取的生產工藝簡便，對環(huán)境的污染少。本文想以生物學方法對GA結構進行改造，通過引入糖(德胺糖)組分，將糖的基因和大環(huán)內酯類化含物的表達相

10、偶聯(lián)，以期改造格爾德霉素的溶解性。 　德胺糖是一種重要的脫氧胺基糖，很多結構相關的大環(huán)內酯類化合物都含有德胺糖，如紅霉素，苦霉素、酒霉素。本研究選用的德胺糖生物合成基因來源予S.venezuelae的des基因簇，其12kb的生物含成基因蔟是由六個結構基因、一個調節(jié)基因和一個外排基因組成，即desⅧ-Ⅶ-Ⅵ-R-V-Ⅳ-Ⅲ-Ⅱ-Ⅰ,可分為desⅧ-Ⅶ-Ⅵ-R和desV-Ⅳ-Ⅲ-Ⅱ-Ⅰ兩個轉錄單元。實驗證明德胺糖可與數種非天然糖苷