蘋果花藥培養(yǎng)純合基因型種質(zhì)創(chuàng)新研究.pdf

1、蘋果(Malus×domestica Brokh.)是童期長、基因組高度雜合且自交不親和的果樹樹種，通過常規(guī)育種手段較難獲得純合基因型種質(zhì)。當(dāng)前蘋果主栽品種屬于雜交嫁接品種，蘊(yùn)含了豐富的優(yōu)良性狀遺傳資源，挖掘新的優(yōu)良純合基因型種質(zhì)親本是加速蘋果育種進(jìn)程的重要步驟。花藥離體培養(yǎng)作為單倍體育種的主要手段，可在短期內(nèi)直接誘導(dǎo)胚狀體形成途徑快速獲得純合基因型新種質(zhì)。這些新種質(zhì)很大程度豐富了蘋果育種親本種質(zhì)資源，為挖掘蘋果優(yōu)良性狀基因提供了重要材

2、料，為后期的田間性狀篩選，雜交育種奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　本研究以早熟多抗品種嘎拉(Gala)、富士(Fuji)和丹霞(Danxia)為試驗(yàn)品種，并采集蘋果單核靠邊期到雙核早期花藥（未開放的花蕾）為實(shí)驗(yàn)材料。首先研究了低溫處理花藥對(duì)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SWEET表達(dá)的影響。經(jīng)在4℃低溫處理10天和30天后，采用定量PCR對(duì)MdSWEET1基因表達(dá)量進(jìn)行檢測。其次對(duì)蘋果花藥經(jīng)低溫預(yù)處理30天后進(jìn)行離體培養(yǎng)，并選用蘋果SSR標(biāo)記對(duì)再生植株進(jìn)行

3、基因型鑒定。最后對(duì)再生植株進(jìn)行植物學(xué)觀察。結(jié)果如下:
　　1.蘋果中MdSWEET1基因編碼一個(gè)含有3個(gè)α-螺旋的跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，N端位于膜外。隨低溫預(yù)處理時(shí)間增加MdSWEET1基因表達(dá)顯著下調(diào)，下調(diào)的MdSWEET1基因表達(dá)可能影響花粉的發(fā)育分化而轉(zhuǎn)向與胚狀體誘導(dǎo)，有利于再生植株的發(fā)生。
　　2.蘋果花藥經(jīng)低溫預(yù)處理30天后進(jìn)行離體培養(yǎng)，共接種“嘎啦”花藥74200個(gè)，從未被污染的5萬多個(gè)花藥中成功誘導(dǎo)形成386個(gè)胚狀體（

4、胚狀體誘導(dǎo)率0.7％），經(jīng)分化培養(yǎng)獲得64株再生苗（植株再生率16.6％）。經(jīng)過繼代培養(yǎng)，最終獲得30個(gè)成活再生株系。FACS流式細(xì)胞儀倍性分析，其中包括28個(gè)二倍體株系，1個(gè)單倍體株系和1個(gè)四倍體株系。同樣的培養(yǎng)體系，獲得9個(gè)“丹霞”再生株系，7個(gè)“富士”再生株系。
　　3.選用130個(gè)蘋果HIDRAS數(shù)據(jù)庫SSR標(biāo)記對(duì)所有植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過凝膠電泳(PAGE)檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，PAGE結(jié)果表明:篩選到20個(gè)SSR標(biāo)記（

5、其余標(biāo)記不具有多態(tài)性或帶型雜亂）可鑒定“嘎啦”再生株系均為花粉（小孢子）單倍體細(xì)胞來源;“丹霞”和“富士”分別篩得16個(gè)SSR標(biāo)記、17個(gè)SSR標(biāo)記以鑒定再生株系來源于單倍體細(xì)胞。
　　4.蘋果有17個(gè)連鎖群，每一個(gè)連鎖群對(duì)應(yīng)一個(gè)SSR標(biāo)記，進(jìn)一步從20個(gè)SSR中篩選出17個(gè)SSR標(biāo)記，采用毛細(xì)管電泳進(jìn)行基因型鑒定對(duì)所獲得的30個(gè)“嘎啦”再生株系。結(jié)果表明這組SSR標(biāo)記能有效區(qū)分鑒定不同再生植株基因型。
　　5.繼代培養(yǎng)60

6、d后的嘎啦再生植株的形態(tài)學(xué)觀察顯示:不同再生株系的株高、葉長、葉寬等特征差異明顯。不同二倍體純合植株的植物學(xué)特征也存在差異:Gala05植株相對(duì)較高，葉基變寬，葉尖漸尖;Gala07葉片變小、變厚，葉柄變短且基部寬大，葉色深且有很強(qiáng)的光澤度;Gala18葉片較小，葉數(shù)較多。純合二倍體再生植株長勢(shì)弱于Gala雜合供體，但強(qiáng)于單倍體和純合四倍體的趨勢(shì)。
　　本研究結(jié)果證明，單倍體花藥離體培養(yǎng)是創(chuàng)制蘋果新種質(zhì)的有效手段。獲得的純合體材料