苦蕎Ⅱ型金屬硫蛋白基因的功能及其啟動子活性分析.pdf

1、金屬硫蛋白(metallothioneins，MTs)是一類富含半胱氨酸的低分子量蛋白，在植物重金屬耐受性中發(fā)揮重要的作用。苦蕎(Fagopyrum tataricum)含有豐富的黃酮類物質，是重要的藥食兩用作物，其具有耐瘠薄、抗重金屬等良好的抗逆性。但目前為止，尚未見有關于苦蕎重金屬抗逆機理和苦蕎金屬硫蛋白表達調控以及功能的相關研究報道。本研究通過克隆苦蕎Ⅱ型金屬硫蛋白基因序列（FtMT2），構建FtMT2過表達的大腸桿菌、酵母及擬南

2、芥，并測定重組蛋白的羥自由基去除能力，以期揭示FtMT2在苦蕎重金屬耐受中的功能;通過FtMT2啟動子序列的克隆，預測啟動子區(qū)的順式作用元件，構建不同截短啟動子的雙熒光素酶報告載體，采用瞬時轉化苦蕎葉肉細胞原生質體研究FtMT2啟動子對Cu2+的響應，以期揭示FtMT2基因啟動子活性的響應模式。FtMT2的克隆及其啟動子的功能分析對于建立Cu2+污染的檢測技術具有參考價值，同時為解析苦蕎重金屬抗性的內在機制奠定了基礎。本研究得到的主要結

3、果和結論有:
　　(1)FtMT2基因含有3個外顯子和2個內含子分隔，內含子邊界符合“5'-GT”和“AG-3'”規(guī)則。FtMT2編碼區(qū)為237bp，編碼78個氨基酸;預測的編碼蛋白的分子質量為7.885kD，等電點4.55，蛋白序列中含有14個Cys，在N-端含有“C-C，C-X-C，C-X-X-C”模體以及高度保守的“MSCCGGNCGCGS”序列，C-端含有3個“C-X-C”模體。N-端和C-端的結構被42個氨基酸的連接區(qū)分

4、隔，這些均為植物Ⅱ型金屬硫蛋白的典型特征。蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示其與雙子葉豆科植物田菁關系最近。
　　(2)生長曲線測定和平板菌落分析結果顯示，FtMT2過表達的大腸桿菌TOP10和釀酒酵母分別對Cu2+和Cd2+耐受性增加。暗示FtMT2在苦蕎對Cu2+和Cd2+的耐受性中發(fā)揮作用。
　　(3)FtMT2重組蛋白的羥自由基去除能力測定結果顯示，羥自由基去除率為50％時的蛋白濃度為46.5μg/mL。暗示FtMT2在苦蕎

5、氧化脅迫耐受性中發(fā)揮作用。
　　(4)通過Genome walking技術克隆得到了2.1kb的FtMT2啟動子，順式作用元件預測結果顯示，該啟動子區(qū)域脫落酸響應元件(abscisic acid responsive element，ABRE)、茉莉酸甲酯響應元件(methyl jasmonate responsive element，MeJa-RE)、熱休克響應元件(heat stress responsive element，

6、HSE)以及參與光響應的“ATCT-motif”、“TCT-motif”“GATA-motif”和“I-box”等。特別指出的是，該序列中存在3個金屬響應元件相似序列(MRE-like sequence):“5'-TGCAG-3'”，該元件與動物MTs基因啟動子上參與重金屬響應的元件相似。
　　(5)啟動子活性分析結果顯示，在無Cu2+處理條件下，不同截短體都具有啟動子活性，暗示FtMT2基因具有一定的本底表達;在Cu2+處理條件

7、下，不同截短體的啟動子活性均顯著上調，其中包含3個金屬響應元件(MRE)的2.1Kb截短體(FtMT2PR1)和2個MRE的1.6Kb截短體(FtMT2PR2)啟動子活性分別提高了6.38倍和6.15倍，含有1個MRE的1.4Kb截短體(FtMT2PR3)啟動子活性提高了3.01倍，而不含預測的金屬響應元件的0.98Kb截短體(FtMT2PR4)啟動子活性也增加1.81倍。結果說明預測的金屬響應元件可能存在劑量效應，并且在啟動子序列中還

8、存在其它重要的金屬響應元件響應于Cu2+的處理。成功構建了1.6kb啟動子及MRE突變體-gus報告基因的植物表達載體，并篩選到了T1代陽性轉基因擬南芥植株，為確定FtMT2的金屬響應元件奠定了基礎;同時為構建重金屬響應的報告系統(tǒng)提供基礎的元件。
　　(6)成功構建pCAMBIA3301-FtMT2過表達載體，并篩選到陽性的擬南芥T2代轉基因植株，為研究FtMT2在植物體內的生物學功能奠定了基礎。以苦蕎植株葉片為材料，采用農桿菌注