化學(xué)合成的海洋甾體YC-1和YC-2對神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用的研究.pdf

1、在上世紀(jì)八十年代，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)有合成甾體的能力。進(jìn)而提出了神經(jīng)活性甾體的概念。神經(jīng)活性甾體(neuroactivesteroids，NASs)是天然存在或者人工合成的在神經(jīng)組織具有活性的所有甾體激素的統(tǒng)稱。神經(jīng)活性甾體對神經(jīng)系統(tǒng)的功能活動(dòng)有著廣泛的調(diào)節(jié)作用。神經(jīng)活性甾體與神經(jīng)元興奮毒性死亡、凋亡有著密切的關(guān)系，并對學(xué)習(xí)記憶有著重要的影響。 隨著社會(huì)的老齡化，阿爾茨海默氏病(Alzheimer'sDisease，AD)、帕

2、金森氏病(Parkinson’sDisease，PD)、腦缺血等疾病的發(fā)病率呈上升趨勢，這類疾病嚴(yán)重威脅著人們的生命健康并往往伴隨著神經(jīng)元的喪失和學(xué)習(xí)記憶能力的下降。目前，這類疾病尚沒有理想的治療方法。實(shí)驗(yàn)表明體內(nèi)某些甾體激素的水平與此類疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。神經(jīng)活性甾體的替代療法已運(yùn)用于臨床，如雌激素用于AD的治療。但是這些甾體的副作用問題也比較突出。因此，深入研究神經(jīng)元凋亡的機(jī)制，并尋找作用特異、保護(hù)效果好、副作用小的甾體藥物是努力的

3、方向之一。 海洋甾體(又稱甾醇類化合物)是來源于海洋生物體內(nèi)的一大類重要的天然化學(xué)成分，它們許多獨(dú)特的結(jié)構(gòu)是在陸生物體內(nèi)所不曾發(fā)現(xiàn)的。迄今為止對海洋甾體的研究重點(diǎn)涉及其溶血、抗炎、細(xì)胞毒和抗腫瘤、抗菌、抗真菌、抗病毒等藥理特性。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明，從南沙群島唇軟珊瑚中提取的四羥基甾醇(氧代固醇)類化合物YC-1能夠抑制低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡，這是首次報(bào)道海洋甾體具有神經(jīng)保護(hù)作用。然而，由于YC-1目前只能從南沙群島唇軟

4、珊瑚等少數(shù)海洋生物中提取得到，采集不易和越來越嚴(yán)格的海洋環(huán)境保護(hù)使其來源十分有限，而且YC-1在這些生物體內(nèi)的含量極微，加上提取步驟煩瑣低效，造成天然品YC-1的純度有限、成本相當(dāng)昂貴，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，大大阻礙了對YC-1藥理學(xué)機(jī)制的深入研究。目前，本實(shí)驗(yàn)室以廉價(jià)的豬去氧膽酸為原料，通過化學(xué)合成的方法得到了YC-1及其類似物YC-2。 本文主要是探討化學(xué)合成的海洋甾體YC-1和YC-2在細(xì)胞模型和動(dòng)物模型上的神經(jīng)保護(hù)作用，并

5、探討了它們的作用機(jī)制，希望能為海洋甾體作用機(jī)制的闡明和防治中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的新藥開發(fā)提供線索和幫助。 第1章海洋甾體YC-1和YC-2對低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡的抑制作用及機(jī)制 低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型是最為常用的凋亡模型。我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，化學(xué)合成的海洋甾體YC-1和YC-2對低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡有明顯的抑制作用，進(jìn)而從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度探討了P13K/Akt通路及MAPK家族成員在YC-1和YC-2抑

6、制小腦顆粒神經(jīng)元凋亡中的作用。 方法:大鼠小腦顆粒神經(jīng)元的分離和原代培養(yǎng)；相差顯微鏡術(shù)(phasecontrastmicroscopy)觀察神經(jīng)元的胞體及突起形態(tài)；Hoechst33258染色觀察神經(jīng)元核及染色質(zhì)的形態(tài)變化；瓊脂糖凝膠電泳(agarosegelelectrophoresis)及溴化乙錠(ethidiumbromide，EB)染色觀察神經(jīng)元DNA的降解特性；二乙酸熒光素(fluoresceindiacetate，F(xiàn)

7、DA)染色檢測神經(jīng)元的代謝活性(metabolicactivity)和存活率(viability)；Westernblotting蛋白免疫印跡法分別檢測Akt、ERK1/2、c-Jun蛋白以及它們各自的磷酸化水平；逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)觀察c-jun基因的表達(dá)水平；westernblotting并檢測凋亡過程中c-Jun上游激酶JNK

8、、p38的活性的變化，探討c-Jun的在低鉀誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡中的激活機(jī)制；定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果以-x±s表示，采用t檢驗(yàn)和方差分析。 結(jié)果:FDA活細(xì)胞染色、Hoechst33258核染色、瓊脂糖凝膠DNA電泳表明10μM/L的YC-1和YC-2能夠抑制低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元的凋亡。YC-1、YC-2對低鉀過程中Akt、ERK的活性無影響；即早基因c-jun在YC-1、YC-2抑制低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡過程中被下調(diào)，c-J

9、un蛋白亦被下調(diào)且活性明顯降低，其上游激酶JNK活性保持不變，但p38活性被下調(diào)。 結(jié)論:化學(xué)合成的海洋甾體YC-1和YC-2能夠抑制低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡，這一作用是通過抑制低鉀過程中c-jun基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)及抑制p38/c-Jun通路來實(shí)現(xiàn)的。 第2章海洋甾體YC-1和YC-2對缺氧/再給氧誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡的抑制作用及機(jī)制 本章建立了缺氧/再給氧(H/R)誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡的模型，進(jìn)而從信號(hào)

10、轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度探討了P13K/Akt通路及MAPK家族成員在缺氧/再給氧誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡中的作用；觀察海洋甾體YC-1、YC-2對缺氧/再給氧誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡的影響，并對其機(jī)制進(jìn)行探討。 方法:小腦顆粒神經(jīng)元的分離培養(yǎng)及凋亡檢測同第一章；westernblotting蛋白免疫印跡法分別檢測Akt、ERK1/2、JNK、p38的活性的變化。新鮮分離海馬神經(jīng)元；應(yīng)用膜片鉗測定海洋甾體YC-1對谷氨酸引起的內(nèi)向電流的影響；應(yīng)用

11、激光共聚焦顯微鏡測定海洋甾體YC-1對谷氨酸引起的鈣內(nèi)流的影響。 結(jié)果:FDA活細(xì)胞染色、Hoechst33258核染色表明缺氧3小時(shí)再給氧24小時(shí)能夠誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡；但瓊脂糖凝膠DNA電泳和流式細(xì)胞儀凋亡峰分析均未發(fā)現(xiàn)DNA斷裂；在缺氧/再給氧誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡的過程中，Akt的活性被抑制；ERK的活性不受影響；p38在缺氧時(shí)被激活；JNK的活性隨著再給氧時(shí)間的延長活性逐漸增強(qiáng)。化學(xué)合成的海洋甾體YC-1和YC-2

12、對缺氧/再給氧誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡有明顯的抑制作用；YC-1、YC-2對缺氧/再給氧過程中Akt、JNK、p38的活性均無影響。在新鮮分離的海馬神經(jīng)元上，YC-1預(yù)處理30分鐘能夠明顯減少谷氨酸引起的內(nèi)向電流；YC-1預(yù)處理30分鐘能夠抑制谷氨酸引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高。 結(jié)論:缺氧3小時(shí)再給氧24小時(shí)能夠?qū)е滦∧X顆粒神經(jīng)元死亡，這一死亡主要是凋亡；該凋亡模型不表現(xiàn)DNA的斷裂。缺氧/再給氧誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡過程中伴隨

13、著Akt活性的降低和JNK、p38活性的增強(qiáng)。化學(xué)合成的海洋甾體YC-1和YC-2能夠抑制缺氧/再給氧誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡，這一作用不足通過激活P13K/Akt通路、抑制JNK和p38的活化來實(shí)現(xiàn)的。YC-1能夠抑制谷氨酸引起的鈣內(nèi)流增加。 第3章應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究海洋甾體YC-1抑制缺氧誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡的差異表達(dá)基因譜 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠表達(dá)譜基因芯片篩選出正常培養(yǎng)的大鼠小腦顆粒神經(jīng)元(N)與缺氧3小時(shí)的小腦顆

14、粒神經(jīng)元(H)、提前1小時(shí)給予10μMYC-1并缺氧3小時(shí)的小腦顆粒神經(jīng)元(YC-1)與缺氧3小時(shí)的小腦顆粒神經(jīng)元(H)的差異表達(dá)基因譜，研究海洋甾體YC-1抑制缺氧誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡過程中的差異表達(dá)基因，初步探討海洋甾體YC-1抑制缺氧誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡在基因水平的機(jī)制。 方法:小腦顆粒神經(jīng)元的分離培養(yǎng)同第一章；應(yīng)用含有31，042條基因的大鼠表達(dá)譜基因芯片，用生物素標(biāo)記探針，檢測正常培養(yǎng)的大鼠小腦顆粒神經(jīng)元、缺氧3

15、小時(shí)的小腦顆粒神經(jīng)元、提前1小時(shí)給予10μMYC-1并缺氧3小時(shí)的小腦顆粒神經(jīng)元的基因表達(dá)情況。 第4章化學(xué)合成的海洋甾體YC-1對局灶性腦缺血的保護(hù)作用 在第1章和第2章中我們分別在低鉀誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型和缺氧/再給氧誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型中觀察了化學(xué)合成的海洋甾體YC-1和YC-2的保護(hù)作用，本章主要觀察化學(xué)合成的海洋甾體YC-1對大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞致局灶性腦缺血的保護(hù)作用。 方法:SD大鼠大腦中

16、動(dòng)脈栓塞(middlecerebralarteryobstruction，MCAO)法制作局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?；行為學(xué)評(píng)分、TTC染色觀察YC-1的保護(hù)作用。 結(jié)果:YC-1能夠減輕MCAO大鼠的行為學(xué)異常；YC-1能夠減少M(fèi)CAO引起的大腦局灶性腦缺血體積。 結(jié)論:化學(xué)合成的海洋甾體YC-1對MCAO致大鼠局灶性腦缺血具有保護(hù)作用。 第5章海洋甾體YC-1脂質(zhì)體LD50的測定及對大鼠局灶性腦缺血的保護(hù)作用本章主