致病性大腸桿菌致細(xì)胞線粒體功能障礙和粘附脫落損傷效應(yīng)分子作用研究.pdf

1、目的： 1、探討致病性大腸桿菌（EPEC）感染宿主上皮細(xì)胞后，效應(yīng)分子EspH的轉(zhuǎn)位、分布以及在EPEC致宿主細(xì)胞粘附、脫落損傷（A/E）中的作用。 2、探討EPEC感染Hela細(xì)胞后，效應(yīng)分子在EPEC致Hela細(xì)胞線粒體功能障礙中的作用。 3、探討EPEC感染TC-7細(xì)胞，參與細(xì)菌粘附及引起腸上皮細(xì)胞微絨毛脫落損傷的效應(yīng)分子。 方法： 1、分別用PCR方法擴(kuò)增espH基因緊鄰上游DNA片段（約

2、500 bp）、卡那霉素開放讀碼框（約1200 bp）和espH基因下游DNA片段（約500 bp），按順序把三個(gè)DNA片段串聯(lián)克隆到PCR克隆載體pSC-A中，再亞克隆該大片段（約2200bp）到自殺質(zhì)粒pCVD442中得到自殺質(zhì)粒pCVD442-△espH：：kana，通過結(jié)合傳遞、等位交換，抗性篩選制備EPEC△espH刪除株，并對(duì)刪除株進(jìn)行PCR鑒定和相應(yīng)染色體DNA區(qū)段做測序鑒定；構(gòu)建帶HA標(biāo)簽的EspH表達(dá)載體pTrc99a

3、-EspH：HA，電轉(zhuǎn)化載體到△espH刪除株制備△espH/pTrc99a-EspH：HA，并用其感染Hela細(xì)胞，Western Blot和免疫熒光技術(shù)檢測EspH的轉(zhuǎn)位以及轉(zhuǎn)位后EspH的分布；構(gòu)建EspH和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）融合表達(dá)質(zhì)粒pEspH-EGFP，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察融合蛋白的分布；并用△espH刪除株感染Hela、Caco-2和TC-7細(xì)胞，分別用熒光顯微鏡技術(shù)，跨上皮細(xì)胞電阻（TER）檢測和

4、掃描電子顯微鏡（SEM）技術(shù)探討EspH在基墊形成，屏障功能障礙和微絨毛脫落損傷中的作用。 2、通過結(jié)合傳遞、等位交換，抗性篩選制備△espF、△map、△map espF等刪除株，并用PCR和Western Blot對(duì)刪除株進(jìn)行鑒定；用制備的刪除株和其他效應(yīng)分子刪除株、質(zhì)粒表達(dá)相應(yīng)效應(yīng)分子互補(bǔ)株或染色體表達(dá)效應(yīng)分子互補(bǔ)株感染經(jīng)用線粒體膜電位試劑盒JC-1染色的Hela細(xì)胞，并用多功能酶標(biāo)儀檢測感染前后線粒體膜電位（MMP）的改

5、變，Western Blot和免疫熒光技術(shù)檢測效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)位及分布，從而探索效應(yīng)分子在EPEC致線粒體功能障礙中的作用及可能機(jī)制。 3、分別用EPEC野生型、Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）刪除株△cfm-14、束狀菌毛（BFP）刪除株△bfpA以及其他效應(yīng)分子刪除株感染經(jīng)極化培養(yǎng)的TC-7細(xì)胞，通過掃描電鏡檢測參與A/E損傷的效應(yīng)分子，并用質(zhì)粒表達(dá)相應(yīng)蛋白互補(bǔ)刪除株，證實(shí)效應(yīng)分子在A/E損傷中的作用。 結(jié)果： 1、酶切

6、、測序及PCR鑒定表明自殺質(zhì)粒pCVD442-△espH：：kana成功構(gòu)建；PCR和測序鑒定表明：△espH刪除株構(gòu)建成功，卡那霉素基因取代espH基因，且△espH刪除株獲得卡那霉素抗性；感染Hela細(xì)胞以后，對(duì)細(xì)胞組分分離，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)：EspH依賴于T3SS轉(zhuǎn)位到宿主細(xì)胞，并在細(xì)胞Tritonx-100可溶性組分中檢測到表達(dá)，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)EspH分布于細(xì)胞膜，基墊形成處；轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EspH與EGFP融合

7、蛋白分布于細(xì)胞膜，且轉(zhuǎn)染的細(xì)胞變成球形；感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：△espH刪除株能有效誘導(dǎo)基墊形成，其降低Caco-2細(xì)胞屏障功能的能力和造成TC-7細(xì)胞微絨毛脫落損傷能力與EPEC野生型相似。 2、PCR和Western Blot證實(shí)：△map、△espF和△map espF等刪除株構(gòu)建成功，MMP檢測發(fā)現(xiàn)：與EPEC野生型相比，△map和△espF刪除株降低線粒體膜電位功能減弱（P<0.05），△map espF雙刪除株功能較△map

8、或△espF進(jìn)一步減弱（P<0.05），但△map espF功能較T3SS刪除株△cfm-14強(qiáng)大（P<0.05），而且，刪除株缺失功能能被質(zhì)粒表達(dá)相應(yīng)蛋白互補(bǔ)，并且，定位于細(xì)胞質(zhì)的突變體EspFL16E也能互補(bǔ)刪除株的功能。對(duì)△eae和△tir刪除株的檢測發(fā)現(xiàn)：其降低MMP功能較野生型顯著減弱（P<0.05），△eae刪除株可以被質(zhì)粒表達(dá)intimin互補(bǔ)，但是△tir不能被質(zhì)粒表達(dá)Tir所互補(bǔ)，但可以被染色體表達(dá)野生型Tir和突變T

9、irY474S所互補(bǔ)，而不能被染色體表達(dá)突變TirS434A互補(bǔ)；而△espG和△espH降低MMP能力與野生型比較無顯著性差異，但△espZ刪除株具有比野生型更強(qiáng)大的功能（P<0.05），Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)：△espZ刪除株轉(zhuǎn)位的Tir蛋白具有不同的磷酸化修飾遷移條帶。 3、EPEC野生型感染TC-7細(xì)胞，最先細(xì)菌呈局限性粘附，菌落呈三維球狀，隨后可見有大量細(xì)菌緊密粘附在細(xì)胞表面，菌落致密平坦，并可見大量微絨毛脫

10、落；BFP刪除株△bfpA感染后只有個(gè)別細(xì)菌粘附，細(xì)胞微絨毛完好；而T3SS刪除株△cfm-14感染細(xì)胞以后，雖有大量細(xì)菌粘附，但細(xì)菌成局限性粘附，且只見微絨毛紊亂，未見微絨毛脫落損傷；外膜蛋白intimin刪除株（△eae）和其受體Tir刪除株（△tir）感染后，可見細(xì)菌皆呈局限性粘附，微絨毛大量脫落，但質(zhì)?；パa(bǔ)表達(dá)相應(yīng)效應(yīng)分子以后，恢復(fù)刪除株到野生型相似表型：而用△espF或△map espF雙刪除株感染后，有大量細(xì)菌粘附，細(xì)菌下陷

11、入微絨毛叢，但是微絨毛脫落損傷輕微，質(zhì)粒表達(dá)EspF互補(bǔ)△espF刪除株后，恢復(fù)刪除株到野生型相似表型。 結(jié)論： 1、EspH是EPEC毒力島基因LEE編碼的一個(gè)依耐T3SS轉(zhuǎn)位的效應(yīng)分子，轉(zhuǎn)位以后，蛋白分布于細(xì)胞膜，基墊形成處，且對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞有一定毒性，但未發(fā)現(xiàn)EspH在EPEC基墊形成、屏障功能障礙和微絨毛脫落方面具有重要作用。 2、EPEC感染Hela細(xì)胞，效應(yīng)分子Map和EspF可以單獨(dú)并協(xié)同地引起線粒體功