p53基因多態(tài)性與病理性瘢痕的相關(guān)性研究及基因檢測試劑盒的構(gòu)建.pdf

1、人的皮膚作為最大的器官擔(dān)負(fù)著保護(hù)人體內(nèi)部結(jié)構(gòu)和各大臟器系統(tǒng)的重要功能，同時(shí)也在細(xì)胞代謝和生長增殖等生理過程發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。瘢痕是一種創(chuàng)傷愈合的結(jié)果，瘢痕在過度增生等情況下，引起機(jī)體不適或造成畸形及功能障礙時(shí)，被認(rèn)為是病理現(xiàn)象，稱之為病理性瘢痕。病理性瘢痕是基因的表達(dá)發(fā)生變化，從而影響到堿基的轉(zhuǎn)換。瘢痕具有獨(dú)特的生長特性及臨床表現(xiàn)，其增殖-凋亡失衡時(shí)導(dǎo)致不斷增生而且難以退化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。P53基因與其有密切的關(guān)系。瘢痕就細(xì)胞學(xué)而言是細(xì)胞過

2、度增生性病變，是指皮膚損傷后，成纖維細(xì)胞活性異常增高，結(jié)締組織過度增殖和透明變性而引起的。近年來國內(nèi)外許多學(xué)者在分子基因水平對病理性瘢痕形成某些機(jī)制進(jìn)行了研究，不少學(xué)者認(rèn)為成纖維細(xì)胞的p53基因的異常表達(dá)是病理性瘢痕形成的重要原因之一。
　　 臨床瘢痕主要分為增生性瘢痕和病理性瘢痕二種。由于增生性瘢痕與病理性瘢痕在臨床表現(xiàn)上相似，以往人們很易混淆兩種疾病的概念。現(xiàn)在的研究已證實(shí)，增生性瘢痕的基本過程為機(jī)體自身過度修復(fù)的結(jié)果，多半

3、是局部性生長，病理性瘢痕臨床表現(xiàn)除了具有一般瘢痕的特性外，還有著“腫瘤樣生長”傾向、病變超出原損傷區(qū)、有特殊的高發(fā)部位、皮膚損傷可逐漸增大、病程長、無自行萎縮傾向、自覺瘙癢、刺痛和知覺減退、單純手術(shù)切除后極易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，病變不超出原損傷區(qū)，增生可以自限，但病程時(shí)間亦較長。
　　 病理性瘢痕的主要病理表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞活性異常增多，結(jié)締組織不斷增殖和透明變性，瘢痕組織內(nèi)膠原及基質(zhì)成分的大量沉積，精確的發(fā)病機(jī)制迄今未明。臨床上因外傷、

4、感染、手術(shù)、燒傷、燙傷或機(jī)械性刺激，或一些非常輕微的損傷（如穿耳、注射或暗瘡破潰）或無明顯的誘因，均可導(dǎo)致病理性瘢痕。病理性瘢痕形態(tài)可呈條狀、圓形、橢圓形或不規(guī)則形的堅(jiān)硬扁平隆起，暗紅色、表面光滑發(fā)亮、無毛發(fā)。青壯年多發(fā)，好發(fā)于頭面部的耳垂、下頜，胸腹部的前胸、四肢的外側(cè)以及女性剖腹產(chǎn)傷口的恥骨聯(lián)合部等特殊部位。
　　 在暴露部位的病理性瘢痕影響美觀，造成容貌破損等，給患者帶來不適和痛苦，造成嚴(yán)重的心理負(fù)擔(dān)。病理性瘢痕是目前整形

5、外科的常見病，人們嘗試用不同的方法來治療，但遺憾的是，到目前為止無論是手術(shù)治療還是非手術(shù)治療，或者是聯(lián)合治療，仍然沒有一種完善的治療方案可以獲得穩(wěn)定又滿意的療效，給整形外科醫(yī)師帶來了工作上的困擾。
　　 病理性瘢痕難以治愈好的主要原因是該病發(fā)病機(jī)制還不十分明確。因此尋找病理性瘢痕的分子機(jī)理成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs），特別是p53基因第7

6、2位密碼子的多態(tài)性引起了人們的高度重視。如何預(yù)測和干擾病理性瘢痕的形成一直是整形外科的研究的熱點(diǎn)。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)瘢痕外周血淋巴細(xì)胞中p53基因外顯子4第72位密碼子的基因型分布存在多態(tài)性，而且這種多態(tài)性分布在普通人群及病理性瘢痕人群中存在差異。這種分布的差異為臨床篩選瘢痕易感人群提供了理論依據(jù)。同時(shí)，為進(jìn)一步推動(dòng)研究的臨床應(yīng)用，并進(jìn)一步研制了p53基因檢測試劑盒。一種可以初步預(yù)測病理性瘢痕易感人群的檢測方法。
　　 基因

7、組序列的差異構(gòu)成了不同個(gè)體與群體對疾病的易感性。人類基因組中存在廣泛的多態(tài)性，最簡單的多態(tài)性形式是發(fā)生在基因組中的單個(gè)核苷酸的替代，單核苷酸多態(tài)性(SNP)指在二條同源染色體上，同源DNA序列長度相等，但個(gè)別核苷酸存在個(gè)體差異。單核苷酸多態(tài)性是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，它是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90％以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500-1000個(gè)堿基對中就有一個(gè)

8、，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬個(gè)甚至更多。由于SNP具有數(shù)量多、分布廣以及篩查快速等優(yōu)點(diǎn)，所以人們普遍認(rèn)為SNP是新一代的遺傳標(biāo)記。本研究擬在前課題組工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步明確p53基因的多態(tài)性與病理性瘢痕的關(guān)系，另一方面通過構(gòu)建檢測p53基因的試劑盒，為篩查病理性瘢痕易感患者提供方便。
　　 實(shí)驗(yàn)的目:
　　 1探討p53基因的多態(tài)性SNP位點(diǎn)與病理性瘢痕發(fā)病的可能關(guān)系，用熒光定量PCR方法，建立篩選人群病理性瘢痕的易感基因的

9、檢測標(biāo)準(zhǔn)。
　　 2研制可用于判斷瘢痕高危個(gè)體的基因檢測試劑盒。
　　 研究對象及方法:
　　 研究對象:一組為瘢痕組，收集臨床上已知的瘢痕患者105例。另一組為健康志愿者組，收集190例。取得知情權(quán)后抽取外周靜脈血樣本及登記相關(guān)臨床資料。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:抽取待測人群的外周靜脈血，提取全血中的DNA樣本;兩組均采用分子信標(biāo)熒光PCR法檢測P53基因codon72多態(tài)性。設(shè)計(jì)一對p53基因第4外顯子的第7

10、2密碼子單核苷酸多態(tài)性(SNP)熒光分子信標(biāo)探針，用Fam熒光分子標(biāo)記CCC，用Hex熒光分子標(biāo)記CGC，在定量熒光PCR(Real-time PCR)儀檢測該位點(diǎn)SNP，并與反向斑點(diǎn)雜交法，DNA直接測序等方法比較。根據(jù)已知p53基因72密碼子SNP基因型樣本的熒光定量測定結(jié)果，制定以下判別標(biāo)準(zhǔn):以熒光強(qiáng)度≥本底熒光2.5倍為陽性反應(yīng)。單純MBC探針（Fam綠色熒光）陽性判定為CCC/CCC純合子;單純MBG探針（HEX紅色熒光）陽性

11、判定為CGC/CGC純合子;MBC探針（Fam綠色熒光）和MBG探針(HEX紅色熒光)雙陽性判定為CCC/CGC雜合子。通過二種不同的熒光，顯色不同結(jié)果判定待檢者p53基因外顯子4第72位密碼子的基因型，通過比較，判斷這種方法的優(yōu)勢。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 本組實(shí)驗(yàn)共檢測了臨床瘢痕組105例及健康組190例的血樣本中的p53基因codon72基因表達(dá)。瘢痕組中p53基因外顯子4第72位密碼子顯示基因型為C/C型為78人

12、，占總數(shù)的74.29％;顯示基因型為C/G型為18人，占總數(shù)的17.14％;顯示基因型為G/G型為9人，占總數(shù)的8.57％，與DNA測序結(jié)果相同。
　　 統(tǒng)計(jì)健康組的基因型分布情況為:健康組中p53基因codon72顯示基因型為脯氨酸(C)/脯氨酸(C)型為43人，占總數(shù)的22.05％;顯示基因型為脯氨酸(C)/精氨酸(G)型為70人，占總數(shù)的35.90％;顯示基因型為精氨酸(G)/精氨酸(G)型為77人，占總數(shù)的39.69％。

13、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示:臨床上應(yīng)用分子信標(biāo)熒光PCR法對p53基因codon72多態(tài)性的檢測，基因型為C/C與基因型為C/G+G/G術(shù)后發(fā)生病理性瘢痕的風(fēng)險(xiǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且高于基因型為C/G+G/G的患者(P＜0.01)。C/C純合子與其他基因型相比較，與病理性瘢痕有較高的相關(guān)性，存在病理性瘢痕患病風(fēng)險(xiǎn)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　 成功地建立了簡單、快速和精確地分析瘢痕體質(zhì)相關(guān)易感基因單核苷酸多態(tài)性的方法;這些易感基

14、因單核苷酸多態(tài)性可能與病理性瘢痕發(fā)病相關(guān)。熒光探針標(biāo)記法創(chuàng)新了檢測p53基因的方法，準(zhǔn)確率高，更方便快捷，可以作為預(yù)測病理性瘢痕易感人群的檢測手段對判斷病理性瘢痕高危個(gè)體具有指導(dǎo)意義。
　　 臨床意義:
　　 推廣和應(yīng)用，為臨床預(yù)測病理性瘢痕易感人群提供一種可能。試劑盒的成功研制對病理性瘢痕易感人群的篩查，有臨床指導(dǎo)意義。為需要手術(shù)的患者預(yù)測病理性瘢痕的患病風(fēng)險(xiǎn)，提前做好瘢痕的預(yù)防性治療，減少了心理負(fù)擔(dān)。盡量減少病理性瘢

15、痕發(fā)生的可能性。一旦檢測出陽性結(jié)果，對于未發(fā)病的瘢痕易感者可以給予盡早的警示，盡量避免穿耳、擠破暗瘡等不必要的損傷，降低患病風(fēng)險(xiǎn)，及時(shí)給予患者避免瘢痕增生的警示和增強(qiáng)易感者自我防治的意識。PCR熒光分子信標(biāo)檢測技術(shù)優(yōu)于PCR-反向斑點(diǎn)雜交法，更適合臨床應(yīng)用，給患者帶來了福音，給瘢痕體質(zhì)的人們開啟了另一扇窗戶。檢測p53基因codon72多態(tài)性SNP位點(diǎn)的試劑盒新方法具有檢測準(zhǔn)確、迅速、使用方便、成本不高等優(yōu)點(diǎn)，臨床上可以考慮作為檢測病理