STAT5b靶控報告基因檢測IR激酶活性細胞模型的建立.pdf

1、目的：根據(jù)胰島素受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，構(gòu)建STAT5b應(yīng)答元件靶控報告基因的細胞模型，通過檢測報告基因表達水平間接監(jiān)測胰島素受體(IR)激酶活性，從而為高通量地篩選出以IR激酶為靶標的藥物提供新的細胞模型。 方法：(1)轉(zhuǎn)染方案的選擇：通過對pEGFP-3與脂質(zhì)體不同的轉(zhuǎn)染比例，轉(zhuǎn)染HepG2細胞表達GFP效率比較，確定最佳的轉(zhuǎn)染方案。(2)轉(zhuǎn)染細胞模型的建立和驗證：STAT5b靶控報告基因(聯(lián)合或不聯(lián)合IR基因及聯(lián)合或不聯(lián)合

2、STAT5b基因)對HepG2細胞或CHO細胞的轉(zhuǎn)染，檢測胰島素對轉(zhuǎn)染細胞STAT5b靶控報告基因表達的影響，并比較分析聯(lián)合或不聯(lián)合IR基因及聯(lián)合或不聯(lián)合STAT5b基因?qū)毎Ｐ挽`敏性的影響，選擇最佳的細胞轉(zhuǎn)染模型。(3)考察胰島素對細胞模型的量效和時效的關(guān)系。(4)通過IR激酶抑制劑考察細胞模型的特異性。(5)通過Z'因子考察細胞模型的穩(wěn)定性。(6)利用MTT法考察胰島素對細胞增殖功能的影響。 結(jié)果：(1)用pEGFP-C3

3、轉(zhuǎn)染HepG2細胞來確定質(zhì)粒DNA與lipofectamineTM2000最佳轉(zhuǎn)染方案為質(zhì)粒DNA(μg)∶lipofectamineTM2000(μl)=1∶2。(2)HepG2細胞株與質(zhì)粒組合的考察，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染外源性的人胰島素受體pRC/CMV·hIR質(zhì)?？梢燥@著提高細胞模型的靈敏度。(3)CHO細胞株與質(zhì)粒組合的考察，結(jié)果表明STAT5b蛋白在誘導(dǎo)Luc表達中發(fā)揮著重要作用的，本實驗通過共轉(zhuǎn)染pBS-SK-STAT5b質(zhì)?？梢赃_

4、到此目的。分析比較兩種細胞株的實驗結(jié)果，本實驗選用pSTAT5b3-TK-LUC、pSV-β-Gal、pRC/CMV·hIR與pBS-SK-STAT5b四種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO細胞建立細胞模型。在10-7mol/L胰島素濃度下處理12小時誘導(dǎo)表達率為6.10倍達到最大值。通過胰島素對誘導(dǎo)Luc表達率的量效和時效的探討，發(fā)現(xiàn)胰島素對Luc誘導(dǎo)表達呈現(xiàn)出時效和量效的依賴性，并且胰島素作用濃度范圍較寬，實驗靈敏度高，符合高通量篩選的要求。(4)模

5、型特異性的考察，通過受體酪氨酸激酶磷酸化抑制劑TyrphostinAG1024，在10μmol/L濃度下處理細胞時，即可使胰島素對報告基因表達的誘導(dǎo)率下降到陰性對照的84.53％；共轉(zhuǎn)染pMT2-wt1B質(zhì)粒表達的PTP1B蛋白可使受體酪氨酸激酶酪氨酸殘基保持去磷酸化狀態(tài)，使胰島素誘導(dǎo)表達率從6.10倍下降到1.24倍。(5)模型穩(wěn)定性的考察，Z'因子只與實驗的重現(xiàn)性與可靠性有關(guān)而與實驗內(nèi)容無關(guān)，Z'因子在0.5～1時，模型穩(wěn)定性高。本

6、實驗根據(jù)Z'因子的計算公式計算所得的Z'因子為0.61，說明所建立的細胞模型有良好的穩(wěn)定性與可重復(fù)性。(6)胰島素對CHO細胞增殖的影響考察，在10-13～10-4mol/L胰島素濃度下處理不同時間，采用MIT法在570nm處檢測A值，結(jié)果表明本實驗所選用的10-7mol/L胰島素濃度處理12小時對細胞增殖無影響，不會影響模型的精確性與可靠性。 結(jié)論：通過對建立的STAT5b靶控報告基因檢測IR激酶活性細胞模型的各項性能的檢測結(jié)