基于雙報告基因的α1-AR亞型選擇性拮抗劑高通量篩選模型的建立及應用.pdf

1、良性前列腺增生（Benign prostatic hyperplasia，BPH）是一種中老年男性常見的疾病，主要表現為增生部分擠壓尿道，導致包括下尿路梗阻（LUTS）在內的一系列排尿障礙癥狀。BPH以其較高的發(fā)病率及潛在導致各種并發(fā)癥的可能性，嚴重降低了患者的生活質量，如不及時治療，甚至可能危及患者的生命。α1-腎上腺素受體（α1-adrenegic receptor，α1-AR）是G蛋白偶聯受體家族（GPCRs）的成員之一。一般將α

2、1-AR分為3種亞型：α1A-AR、α1B-AR和α1D-AR。研究發(fā)現，人體前列腺組織中的α1-AR主要為α1A-AR（63％）,α1D-AR次之（31%），而以α1B-AR所占比例最少（6%）。拮抗α1A-AR可從根本上緩解尿路梗阻癥狀，拮抗α1D-AR可以改善逼尿肌功能失調的刺激性和灌注性排泄癥狀，而α1B-AR將可能產生嚴重的心血管副作用。選擇性作用于α1A-AR和α1D-AR而對α1B-AR弱拮抗或不拮抗的選擇性α1-AR拮抗

3、劑，可有效降低病變前列腺平滑肌張力的同時盡量規(guī)避產生副作用的風險,以此減輕BPH導致的尿道梗阻癥狀。
　　藥物的高通量篩選技術（High throughput screening，HTS）是近年來在藥學領域興起的一種新型篩選模式。作為一種研究藥物活性成分以及活性化合物初期發(fā)現和篩選的核心方法，HTS正被越來越多地應用于各種藥理研究實驗和藥物篩選平臺。它是利用藥靶分子或細胞水平的生物學機制，以微孔板為基礎，進行大量大規(guī)模篩選的技術，

4、以期找到能高選擇性地作用于藥物作用靶點的具有一定生物化學活性的目標化合物。這一方法易于實現自動化操作且高效快捷，適用性廣，可與多種初步篩選技術搭載聯用，大大提升了初篩技術的藥物篩選規(guī)模和應用價值，能在最短的時間內實現目標化合物的批量篩選。
　　本人所在課題組在抗良性前列腺增生領域做了大量工作，課題組前期展開了大量合成工作，已建立起芳基哌嗪類化合物庫，在庫化合物277個，迫切需要建立一個高通量篩選方法，快速高效的對化合物進行篩選。由

5、于α1-AR的其中兩種亞型（α1A/D-AR）提供了在治療良性前列腺增生（BPH）方面的重要靶點作用，基于GPCRs的信號通路特點，我們分別以α1(A/B/D)-AR受體為藥物作用靶點，建立了體外針對α1-AR亞型選擇性拮抗劑的藥物高通量篩選模型，擬從中獲得效果明確、選擇性高且副作用低的α1A/D-AR拮抗劑。
　　我們將構建好的α1-AR目的基因質粒（ADRA1A、ADRA1B和ADRA1D）分別與報告基因質粒CRE-LUC、內

6、參質粒pRL-SV40共轉染到HEK293細胞中，加入相應的α1-AR拮抗劑，通過檢測胞內雙熒光素酶報告基因的相對表達水平來達到篩選所需α1-AR拮抗劑的目的。同時，我們還從細胞匯合度、脂質體含量、實驗報告基因載體類型、三種載體基因DNA含量之比、轉染持續(xù)時間以及所添加藥物化合物的終濃度、作用時間、細胞裂解時間等方面對這一篩選模型進行了相關優(yōu)化并考察了該模型的穩(wěn)定性因素。
　　結果：本實驗藥物篩選模型的最佳實驗條件最終確定為：采用

7、HEK293細胞為受試細胞株；瞬時共轉染時細胞匯合度為80%-90%；采用CRE-LUC作為實驗報告基因；三種載體質粒DNA含量之比為1：1：1；采用脂質體2000作為瞬轉介導工具；轉染后18h左右進行給藥刺激；對于細胞培養(yǎng)板中的每個孔，DMSO添加終濃度百分比為1%，其他藥物化合物終濃度均為10-5mol/L；藥物作用時間為8-10h；細胞裂解時間為40min；檢測最佳條件：每個測試孔添加一定體積細胞內容液，自動添加25μL/孔LAR