耐多藥結(jié)核菌對(duì)青蒿素類單體敏感性及結(jié)核多肽特異性細(xì)胞內(nèi)因子多色流式分析.pdf

1、結(jié)核病為現(xiàn)今世界上最普遍和嚴(yán)重的傳染病之一，隱性感染者的診斷及耐藥結(jié)核菌的治療都困擾著人們。因此耐藥結(jié)核菌的治療及隱性感染者的診斷這二方面是結(jié)核病研究的重要領(lǐng)域，現(xiàn)將本人在這此方面的試驗(yàn)研究做一簡(jiǎn)述。
　　 第一部分青蒿素類耐藥實(shí)驗(yàn)及逆轉(zhuǎn)
　　 [目的]近年來(lái)結(jié)核發(fā)病率不斷上升，耐利福平(RFP)或異煙肼(INH)等單一耐藥菌及多重耐藥結(jié)核菌(MDR-TB)或泛耐藥結(jié)核菌(XDR-TB)均不斷增加，但卻沒有新化學(xué)結(jié)構(gòu)類藥

2、物應(yīng)用于臨床治療。結(jié)核分枝桿菌(以下簡(jiǎn)稱結(jié)核菌)的逆轉(zhuǎn)是指將耐藥細(xì)菌逆轉(zhuǎn)到正?；蚪咏５那闆r。由于耐多藥或超級(jí)耐藥結(jié)核菌的增加，而臨床治療及制藥業(yè)均對(duì)此束手無(wú)策，因此逆轉(zhuǎn)耐藥性成為結(jié)核治療的一個(gè)可嘗試的新理念。傳統(tǒng)中醫(yī)藥歷史悠久，其豐富的資源有利于開發(fā)出新的抗菌藥物；從中藥青蒿中得到的青蒿素類單體如蒿甲醚、青蒿琥酯及二氫青蒿素已廣泛應(yīng)用于瘧原蟲、血吸蟲等原蟲的治療，并且其研究范圍擴(kuò)大到抗腫瘤治療等。本實(shí)驗(yàn)初步研究中藥青蒿素類單體青蒿琥

3、酯及二氫青蒿素單獨(dú)或者聯(lián)合RFP或INH對(duì)相應(yīng)耐藥結(jié)核菌的作用，探索其是否具有抗結(jié)核分枝桿菌以及是否可聯(lián)合RFP或INH降低或逆轉(zhuǎn)結(jié)核菌耐藥性。
　　 [方法]刃天青顯色法判斷各中藥單體是否具有抑菌或殺菌作用；MB/BACT系統(tǒng)(生物梅里埃)檢測(cè)RFP或INH聯(lián)合中藥單體是否具有協(xié)同或逆轉(zhuǎn)結(jié)核菌耐藥性。
　　 [結(jié)果]單獨(dú)使用時(shí)各單體均不能殺滅結(jié)核分枝桿菌；RFP聯(lián)合青蒿琥酯(200μg/ml)或二氫青蒿素(200μg/

4、ml)可使11株耐RFP菌株中的9或6株變?yōu)槊舾校舾新史謩e為82％或55％；INH聯(lián)合上述中藥單體則亦可使11株耐INH菌株中的10或7株變?yōu)槊舾?，敏感率分別為90％或64％。
　　 [結(jié)論]青蒿琥酯及二氫青蒿素有較強(qiáng)的協(xié)同或逆轉(zhuǎn)結(jié)核菌的耐藥性的作用，但青蒿琥酯敏感率較二氫青蒿素更高。
　　 第二部分多肽活化結(jié)核特異性細(xì)胞內(nèi)因子的研究
　　 [目的]許多結(jié)核病患者的診斷缺乏明確的實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù)，而經(jīng)過(guò)治療的患者

5、有時(shí)亦不能明確病菌的清除狀況等，未感染者缺乏有效的保護(hù)性疫苗來(lái)減輕或免除感染結(jié)核菌。如果能找到合適的抗原，這些問(wèn)題都將可能得以解決。建立檢測(cè)多參數(shù)胞內(nèi)細(xì)胞因子流式細(xì)胞術(shù)，通過(guò)檢測(cè)單一淋巴細(xì)胞水平上的多種胞內(nèi)細(xì)胞因子，可以很方便而有效地檢測(cè)抗原特異性細(xì)胞的類型及功能，更好地了解抗原的特性；多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)不僅能節(jié)約昂貴人力物力及標(biāo)本，而且能更好地檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞的不同功能類型。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在單細(xì)胞水平上同時(shí)檢測(cè)表面CD3、CD4、CD8及胞內(nèi)I

6、FN-γ、IL-4和TNF-α等6項(xiàng)參數(shù)，從而分析實(shí)驗(yàn)所用的多肽抗原的性能，確定6條多肽抗原的特異性及之間的區(qū)別，包括刺激產(chǎn)生各種細(xì)胞因子的強(qiáng)弱，以及CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞受刺激后的差異并了解活化后多功能T淋巴細(xì)胞的百分率等。
　　 [方法]運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)及胞內(nèi)細(xì)胞因子染色等方法，分析多肽活化后產(chǎn)生的各種胞內(nèi)細(xì)胞因子及相應(yīng)的細(xì)胞類型。
　　 [結(jié)果]1.各多肽均能刺激活化結(jié)核組患者PBMC產(chǎn)生IFN-γ等細(xì)胞因子

7、，但產(chǎn)生因子的百分率較低；IFN-γ及IL-4基本上小于1％，而TNF-α則在10％左右。與正常組相比，IFN-γ及TNF-α的均值分別有1～12倍或1～3倍的升高，IL-4+/C D4+T淋巴細(xì)胞活化率的倍數(shù)較小，而IL-4+/CD8+的倍數(shù)則較大；2.不同多肽刺激產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)因子的比較：除多肽H256與H210活性IFN-γ陽(yáng)性CD4+亞群上有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其余各多肽問(wèn)沒有明顯的差異；3.在6條多肽中的任意一條的刺激下，CD8+淋巴細(xì)

8、胞亞群比CD4+亞群其TNF-α陽(yáng)性百分率更高，但其余細(xì)胞因子如IFN-γ及IL-4均無(wú)CD4+或CD8+亞群差異，雖然趨勢(shì)上存在差別；4.雙陽(yáng)性(IFN-γ及TNF-α陽(yáng)性)多功能T淋巴細(xì)胞百分率分析，經(jīng)多克隆刺激劑活化后，IFN-γ+/CD4+及IFN-y+/CD8+T細(xì)胞則分別有(均值)83.0％及79.9％為雙陽(yáng)性細(xì)胞，而經(jīng)多肽刺激后則有(均值)68.1％及65.7％。
　　 [結(jié)論]多參數(shù)流式胞內(nèi)因子染色能很好地用于抗