河南省耐多藥結(jié)核菌耐藥相關(guān)基因的分子流行病學(xué)研究.pdf

1、中國是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一,患病人數(shù)僅次于印度居世界第二。我國的耐藥結(jié)核病流行狀況也很嚴(yán)重,耐多藥(MDR)結(jié)核的流行比例為9.3％,約是世界平均水平的2倍。耐多藥結(jié)核病治療周期長、藥物副作用大,而且治愈率低、死亡率高。因此,耐多藥結(jié)核病的控制對于中國當(dāng)前結(jié)核病的防治具有重要意義。
　　 早期快速診斷結(jié)核分枝桿菌的耐藥性有利于耐多藥結(jié)核病的治療和控制。和基于培養(yǎng)的藥敏檢測方法相比,基于分子生物學(xué)的藥敏檢測方法具有快速、

2、敏感和成本較低的優(yōu)勢。目前,已有商品化的產(chǎn)品INNO-LiPARif.TB(Innogenefics,Belgium)和GenoType MTBDR plus(Genotype MTBDR；Hain Lifescience,Nehren,Germany)被WHO認(rèn)為可以用于結(jié)核耐多藥性的快速診斷。但是由于不同地區(qū)流行菌株的耐藥相關(guān)基因突變頻率和類型不同,這些工具檢測耐藥性的靈敏度和特異度在不同地區(qū)也不同。因此,對于不同地區(qū)菌株的耐藥相關(guān)

3、基因突變頻率和類型的全面了解,有利于這類新的診斷技術(shù)的開發(fā)和廣泛應(yīng)用。
　　 在中國對耐藥結(jié)核菌,特別是耐多藥結(jié)核菌的耐藥相關(guān)基因的突變頻率和突變類型進(jìn)行的研究還很少。我們試圖通過改善的、全面的結(jié)核分支桿菌耐藥相關(guān)基因的研究,對河南省耐多藥結(jié)核菌4個(gè)一線抗結(jié)核藥耐藥相關(guān)基因的突變頻率和突變類型進(jìn)行詳細(xì)描述,并對各個(gè)耐藥相關(guān)基因的的變異規(guī)律進(jìn)行了深入的探討,為開發(fā)適合該地區(qū)耐多藥結(jié)核菌的高靈敏度和特異度的診斷方法提供更多的數(shù)據(jù)。<

4、br>　　 本研究中共收集來自河南省不同地區(qū)的115株耐多藥結(jié)核菌和22株對一線4個(gè)抗結(jié)核藥全敏感的菌株。使用WHO推薦的比例法檢測菌株對一線4個(gè)抗結(jié)核藥的藥物敏感性,獲得菌株的耐藥特征。
　　 我們檢測了所有已知的一線4個(gè)抗結(jié)核藥物的9個(gè)耐藥相關(guān)基因的編碼區(qū)全長和部分啟動(dòng)子區(qū),以期能獲得相關(guān)基因突變頻率和突變類型的更全面信息。通過對河南115株耐多藥結(jié)核菌4個(gè)一線抗結(jié)核藥的耐藥相關(guān)基因突變特征的全面分析,我們發(fā)現(xiàn):
　

5、　 (1)本研究利福平和異煙肼耐藥相關(guān)基因所有的已知突變的總突變頻率沒有明顯改變,如:本研究rpoB所有的已知突變的總突變頻率為97.3％,與多數(shù)研究報(bào)道的95％到98％一致。此外,MDR菌株中各耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)的突變頻率的順位沒有改變。如:rpoB531>rpoB526>rpoB516,rpsL43>rpsL88>rrs513。
　　 (2)同一地區(qū),在MDR菌株較多或全部為MDR菌株的研究中,多個(gè)耐藥相關(guān)基因的主要突變位點(diǎn)

6、的突變頻率高于MDR菌株較少或單耐藥菌株的研究,這些突變位點(diǎn)有rpoB531、katG315、embB306、rpsL43。此外,有的耐藥相關(guān)基因的突變,如:embB306和rpsL43,在MDR菌株中會(huì)出現(xiàn)在該突變對應(yīng)耐藥性的敏感菌株。
　　 (3)共發(fā)現(xiàn)53個(gè)新突變位點(diǎn),16個(gè)新突變類型,這些新突變位點(diǎn)和類型在MDR結(jié)核菌的耐藥發(fā)生中的作用需要進(jìn)一步研究。
　　 此外,我們還利用已獲得的耐多藥結(jié)核菌耐藥相關(guān)基因突變特

7、征及其耐藥特征數(shù)據(jù),對embB基因突變(包括embB306突變)和MDR結(jié)核菌耐藥性間的關(guān)系進(jìn)行了分析,得到了如下結(jié)論:
　　 (1)在MDR結(jié)核菌中,embB基因上的突變,包括embB306突變,和乙胺丁醇耐藥統(tǒng)計(jì)學(xué)上相關(guān)。單獨(dú)檢測embB306突變預(yù)測乙胺丁醇耐藥靈敏度不高(62.7％),通過檢測embB基因所有突變,可以提高靈敏度至89.6％。這提示embB基因上多個(gè)位點(diǎn)均可能參與了乙胺丁醇的耐藥發(fā)生,大多數(shù)突變集中在30

8、0到500密碼子間。某些對乙胺丁醇敏感的MDR菌株發(fā)生embB基因突變(包括embB306突變),這與多數(shù)研究結(jié)論一致,表明embB基因突變不僅和乙胺丁醇耐藥相關(guān),還可能與MDR相關(guān)。
　　 (2)總體上embB306位點(diǎn)突變菌株比例隨耐藥數(shù)目增加而增加,趨勢卡方檢驗(yàn)顯示相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。但耐3藥組embB306位點(diǎn)突變菌株比例低于耐2藥組,這可能是因?yàn)楸狙芯恐心玩溍顾氐腗DR菌株發(fā)生突變的比例(17.9％)較低；也可能是因

9、為耐2藥(MDR)組樣本量較少而影響了統(tǒng)計(jì)分析的穩(wěn)定性。同樣,embB基因各位點(diǎn)總和突變與耐藥數(shù)目增加的相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,其中發(fā)生embB497突變的MDR菌株在耐4藥組明顯多于耐3藥組,提示embB基因其他位點(diǎn)突變可能也有隨耐藥數(shù)目增加而增加的趨勢。
　　 (3)耐4藥組菌株中有90.2％發(fā)生embB基因突變。通過檢測embB基因4個(gè)位點(diǎn)的突變(embB306、embB354、embB406和embB497)可以發(fā)現(xiàn)83.