弓形蟲三磷酸核苷水解酶Ⅱ重組蛋白和單抗的制備與應用.pdf

1、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種全球分布的機會致病性原蟲，可在人和動物的所有有核細胞內寄生和繁殖，引起人畜共患的弓形蟲病，孕婦及免疫缺陷人群感染后可引起嚴重的后果。三磷酸核苷水解酶(nucleoside triphosphate hydrolase，NTPase)為分布于弓形蟲速殖子表面的一種主要特異性抗原，對蟲體在宿主細胞內的寄生和繁殖都具有重要的作用，是弓形蟲急性感染階段引起機體產生免疫反應的主要抗原，NTPa

2、se蛋白有NTPase-Ⅰ和NTPase-Ⅱ兩種亞型，其中NTPase-Ⅰ僅存在于有毒株，而NTPase-Ⅱ存在于所有弓形蟲株體內[12]，因此NTPase-Ⅱ可用于檢測候選抗原和候選的保護性抗原。本研究將對弓形蟲NTPase-Ⅱ基因進行原核表達，探討NTPase-Ⅱ原核表達蛋白在弓形蟲病早期診斷的應用，并制備其單克隆抗體，研究單抗對弓形蟲的抑制作用。此外，并構建弓形蟲NTPase-Ⅱ基因真核表達載體，為弓形蟲核酸疫苗的研制奠定基礎。

3、 目的： 1.誘導表達弓形蟲融合蛋白NTPase-Ⅱ，建立檢測小鼠血清中剛地弓形蟲NTPase-Ⅱ特異性IgG、IgM抗體的間接ELISA法，探討用于弓形蟲感染早期檢測的應用價值。 2.制備、鑒定抗弓形蟲融合蛋白NTPase-Ⅱ單克隆抗體，通過體外、體內實驗探討單克隆抗體對弓形蟲的抑制作用。 3.構建弓形蟲NTPase-Ⅱ基因真核表達載體，為弓形蟲核酸疫苗的制備奠定基礎。 方法： 1.NTP

4、ase-Ⅱ基因的原核表達 用含重組表達質粒NTPase-Ⅱ-pBAD-HisB的E.coli BL21(DE3)在一定條件下在誘導劑L-阿拉伯糖的作用下進行誘導表達。 2.重組NTPase-Ⅱ融合蛋白的純化及鑒定 使用Ni離子親和層析柱純化重組質粒pBAD-HisB-NTPase表達產生的含組氨酸的重組融合蛋白，SDS-PAGE鑒定其純度。對純化蛋白進行透析復性后，紫外分光光度計測定其濃度。 3.間接EL

5、ISA檢測弓形蟲感染鼠NTPase-Ⅱ抗體 以剛地弓形蟲NTPase-Ⅱ融合蛋白為包被抗原建立間接ELISA法，動態(tài)檢測剛地弓形蟲實驗感染鼠血清NTPase-Ⅱ特異性IgG、IgM抗體變化，試驗設腦囊蟲病、血吸蟲病及肺吸蟲病病人血清對照。 4.單克隆抗體的制備及應用 用融合蛋白NTPase-Ⅱ作為抗原，免疫BALB/c小鼠，共免疫3次，每次間隔2周，末次免疫后3d取小鼠脾細胞及Sp2/0骨髓瘤細胞在聚乙二醇(PE

6、G1500)作用下進行細胞融合，有限稀釋法篩選出高滴度分泌McAb的雜交瘤細胞株，蛋白質印跡(Western blotting)及ELISA分析其特異性，試劑盒測定其免疫球蛋白亞類，初步探討其在弓形蟲診斷及治療中的應用。 5.NTPase-Ⅱ基因真核表達載體的構建 采用PCR方法擴增剛地弓形蟲RH株的NTPase-Ⅱ基因，克隆入pGEM-T easy載體，陽性克隆經酶切與測序鑒定后亞克隆至真核表達質粒PVAX1。

7、 結果： 1.SDS-PAGE結果表明NTPase-Ⅱ基因在E.coli BL21(DE3)中獲得高效表達，表達產物主要存在于包涵體中。融合蛋白的相對分子量(Mr)約70000，與理論值相近。經Nj2+-NTA樹脂純化后純度約為84％。 2.小鼠血清中的抗NTPase-Ⅱ抗體IgM于弓形蟲感染后第3d開始出現陽性反應，IgG抗體于感染后第7d開始出現陽性反應，腦囊蟲病、血吸蟲病及肺吸蟲病病人血清特異性IgG陽性率分別為0

8、、1.92％和0。 3.經篩選獲得能穩(wěn)定分泌抗弓形蟲融合蛋白NTPase-Ⅱ單克隆抗體2株和雜交瘤細胞2株，分別命名為為MNT1和MNT2； Western blotting顯示2株單克隆抗體均能與弓形蟲重組融合蛋白NTPase-Ⅱ發(fā)生特異性結合，ELISA結果顯示2株單克隆抗體均能與弓形蟲速殖子全蟲蛋白及弓形蟲重組融合蛋白NTPase-Ⅱ發(fā)生特異性結合；2株單克隆抗體經免疫球蛋白類和亞類鑒定均為IgG2a；免疫保護實驗表明2株

9、單克隆抗體無法阻止弓形蟲入侵宿主細胞，但卻可抑制弓形蟲在宿主細胞內增殖；動物保護實驗證實2株單抗都有一定的保護作用；免疫熒光定位結果顯示2株單克隆抗體與弓形蟲的結合部位主要是在弓形蟲膜表面。 4.PCR擴增得到特異的剛地弓形蟲NTPase-Ⅱ基因序列，成功構建了真核表達載體PVAX1-NTPase，經測序鑒定亞克隆的NTPase-Ⅱ基因序列與Genebank公布的序列同源性為100％。 結論： 1.本實驗成功表達

10、了弓形蟲NTPase-Ⅱ融合蛋白，間接ELISA檢測弓形蟲感染鼠血清抗體的敏感性和特異性較高，有望應用于弓形蟲感染的早期檢測。 2.制備的抗弓形蟲融合蛋白NTPase-Ⅱ雜交瘤細胞株能分泌識別融合蛋白NTPase-Ⅱ的高特異性單克隆抗體，對單克隆抗體的初步應用顯示其對弓形蟲在宿主細胞內的繁殖具有一定的抑制作用，采用該單抗進行被動免疫具有一定保護效果。 3.成功構建了真核表達質粒PVAX1-NTPase-Ⅱ，為弓形蟲核酸疫