剛地弓形蟲尿苷磷酸化酶基因的生物信息學(xué)分析、克隆表達(dá)及重組蛋白的免疫保護(hù)性研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>　　用生物信息學(xué)方法分析剛地弓形蟲尿苷磷酸化酶（TgUPase）基因編碼蛋白。對TgUPase基因進(jìn)行克隆、表達(dá)，純化重組TgUPase蛋白（rTgUPase）并分析其抗原性。觀察不同劑量rTgUPase滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，探討rTgUPase免疫的適宜劑量。探討rTgUPase作為剛地弓形蟲疫苗候選抗原的可能性。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　第一部分：綜述了不同生物來源的UPase蛋白的理化性質(zhì)及研究進(jìn)展。<

2、br>　　第二部分：對TgUPase基因編碼蛋白進(jìn)行生物信息的分析，預(yù)測其理化性質(zhì)，二級結(jié)構(gòu)以及潛在的抗原表位。
　　第三部分：收集、純化RH株剛地弓形蟲速殖子，提取總RNA。根據(jù)TgUPase基因開放閱讀框（GenBank:DQ385446.1）設(shè)計(jì)引物，引入EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)，RT-PCR擴(kuò)增編碼TgUPase的基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后連接入原核質(zhì)粒pET30a(+)中，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌（E.coli）D

3、H5α，陽性菌落經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定；將重組質(zhì)粒pET30a(+)-TgUPase轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結(jié)合考馬斯亮藍(lán)染色檢測表達(dá)產(chǎn)物，用蛋白質(zhì)印跡（Westernblotting）分析重組蛋白的抗原性。
　　第四部分：40只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組，免疫組分別用10μg、20μg、30μg、40μgrTgUPase溶于總體積為

4、20μl的PBS中，對照組用20μlPBS代替，第0、14和21d各滴鼻免疫1次。末次免疫后14d，眼靜脈叢采血，分離血清。頸椎脫臼處死小鼠，分離脾淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)培養(yǎng)，分別用rTgUPase或ConA刺激脾淋巴細(xì)胞，CCK-8試劑盒測定其增殖指數(shù)。收集小腸、鼻咽、陰道和膀胱沖洗液。ELISA測定血清IgG和IgA水平，4種沖洗液sIgA水平，測定脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ含量。
　　第五部分：60只BA

5、LB/c小鼠隨機(jī)分為2組，免疫組用30μgrTgUPase（溶于20μlPBS），對照組用20μlPBS，第0、14和21d各滴鼻免疫1次。末次免疫后14d，分別用1×104速殖子（慢性感染，免疫組和對照組各10只）或4×104速殖子（致死性感染，免疫組和對照組各20只）灌胃攻擊小鼠。攻擊后30d，頸椎脫臼處死慢性感染小鼠，分離計(jì)數(shù)肝、腦組織內(nèi)速殖子。逐日觀察和記錄致死性感染小鼠健康狀況，計(jì)算30d存活率。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　

6、　rTgUPase蛋白由303個氨基酸組成，分子量為33042.9，等電點(diǎn)理論值為6.66，為可溶性蛋白，不含有信號肽，有11個翻譯后修飾位點(diǎn)，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中，有6個潛在的T、B細(xì)胞聯(lián)合抗原表位。
　　RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為921bp，菌落PCR、雙酶切以及測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒pET30a(+)-TgUPase構(gòu)建成功。SDS-PAGE結(jié)果表明，經(jīng)IPTG37℃誘導(dǎo)目的基因在E.coliBL21（DE3）中高效表達(dá)，獲得相

7、對分子量（Mr）約39kDa的可溶性重組蛋白。Westernblotting顯示，誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白質(zhì)具有HIS標(biāo)簽，且能被兔抗弓形蟲免疫血清識別。
　　小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明30μg組最高，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。30μg和40μg組血清IgG和IgA水平高于對照組（P<0.01）；免疫組（10μg、20μg、30μg、40μg組）腸沖洗液IgA水平與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；30μg和40μg組陰道沖

8、洗液IgA水平高于對照組（P<0.05和P<0.01）；30μg和40μg組膀胱沖洗液IgA水平高于對照組（P<0.05）；30μg組鼻咽沖洗液IgA水平顯著高于對照組（P<0.05）；IL-2水平30μg、40μg組與對照組差異顯著（P<0.01和P<0.05）；與對照組相比，免疫組IL-4水平均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；20μg、30μg、40μg組IFN-γ水平均高于對照組（P<0.05，P<0.01，P<0.01）

9、。rTgUPase滴鼻免疫可以誘導(dǎo)小鼠的免疫應(yīng)答反應(yīng)，30μg組可以更有效地誘導(dǎo)黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答。
　　慢性感染免疫組肝和腦組織內(nèi)蟲荷（30.15±6.46×105/g和9.16±0.47×105/g）均顯著低于對照組（62.52±8.96×105/g和18.18±1.03×105/g）（F=62.594，P<0.01和F=450.382，P<0.01），減蟲率分別為51.78％和49.61%。致死性感染免疫組30d生存率為21

10、.1%，而PBS組小鼠在攻擊后第12d全部死亡，兩者的生存率曲線分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（c2=6.146，P<0.05）。
　　結(jié)論
　　生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示剛地弓形蟲UPase基因編碼的蛋白為可溶性蛋白，具有抗原性，我們成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-TgUPase并在E.coli中高效表達(dá)可溶性蛋白，并通過Westernblot證實(shí)rTgUPase具有抗原性。rTgUPase滴鼻免疫能有效誘導(dǎo)黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答，并有效抵抗