靶向livin基因沉默對胰腺癌PANC1細(xì)胞增殖凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：Livin是與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的凋亡抑制蛋白家族(inhibitorofapoposisproteins,IAps)中的新成員,能夠與內(nèi)源IAP抑制劑SMAC和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族成員caspase-3,caspase-7,caspase-9結(jié)合,發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用。它特異性高表達(dá)于多種實(shí)體腫瘤組織,影響腫瘤細(xì)胞的生長,使腫瘤細(xì)胞對放化療耐受。有研究表明,Ljvin基因在人胰腺癌組織中高表達(dá),而在胰腺癌癌旁組織中

2、低表達(dá)或不表達(dá)。RNA干擾(RNAi)能高效特異地調(diào)低基因表達(dá),已廣泛應(yīng)用于腫瘤治療的研究。本研究旨在采用RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染胰腺癌PANC1細(xì)胞,觀察其對人胰腺癌細(xì)胞PANC1增值凋亡的影響,探討livin基因在胰腺癌中的作用,為進(jìn)一步研究胰腺癌的基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：①設(shè)計(jì)并體外化學(xué)合成針對livin基因的小干擾RNA序列,以脂質(zhì)體(lipofectamineTM2000)為載體轉(zhuǎn)染具有高侵襲潛能低分化人胰腺癌細(xì)胞株

3、PANC1,流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率,確定PANC1細(xì)胞最佳轉(zhuǎn)染條件,采用RT-PCR法測定轉(zhuǎn)染后PANC1細(xì)胞Livin及內(nèi)參GAPDH的mRNA表達(dá),測定干擾效率,以篩選出最有效干擾序列。②用最有效序列靶向沉默對數(shù)生長期PANC1細(xì)胞基因表達(dá),分別檢測不同時(shí)間段檢測livin mRNA表達(dá)水平的變化,并用RT-PCR法和紫外分光光度法檢測轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間段Caspase-3的mRNA及蛋白水平變化。MTT法檢測不同時(shí)間段細(xì)胞增殖活性變化

4、,繪制生長曲線。③流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染法檢測轉(zhuǎn)染livin-siRNA后不同時(shí)間段PANC1的凋亡率。
　　 結(jié)果：①細(xì)胞數(shù)約為每孔2.0x105個(gè)、siRNA濃度約為80nmol/L,Lipofectamine2000與siRNA比例為2:4(24孔板)時(shí),有較佳的轉(zhuǎn)染效率,繼續(xù)提高siRNA濃度并不能明顯提高轉(zhuǎn)染效率；②Livin-siRNA3轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞后livin mRNA表達(dá)降低最為顯著,顯示出

5、最佳的干擾效率；干擾效率能夠至少維持至轉(zhuǎn)染后的72h；③轉(zhuǎn)染了Livin-siRNA3后PANC1細(xì)胞Caspase-3無論在mRNA水平還是蛋白水平表達(dá)均增高,轉(zhuǎn)染了Livin-siRNA3的PANC1細(xì)胞細(xì)胞增殖能力下降,凋亡增加,Livin基因沉默與Caspase-3蛋白酶活性呈明顯負(fù)相關(guān)
　　 結(jié)論：Livin-siRNA能有效沉默PANC1細(xì)胞Livin基因表達(dá),抑制PANC1細(xì)胞增殖,顯著誘導(dǎo)胰腺癌PANC1細(xì)胞凋亡