基于改進的高通量酵母雙雜交技術平臺研究人類肝臟重要蛋白質的相互作用.pdf

1、肝臟是人體最大的代謝器官，在人體中具有不可替代的重要生理功能。研究肝臟內重要蛋白質的相互作用是理解肝臟生理功能與分子機制的基礎。本論文利用改進的高通量酵母雙雜交技術平臺來研究人肝臟重要蛋白質的相互作用，為初步描繪人類肝臟重要蛋白質相互作用連鎖圖打下了一定的基礎。其內容主要有以下幾個方面：(1)酵母雙雜交誘餌載體pDBlg的構建：最初的雙雜交系統(tǒng)是invitrogen公司的PROQUSTTMTwo-hybridsystem，在此將其誘餌載

2、pDBLeu載體作出了改進：在其多克隆位點處引入兩個識別位點不一樣的Bsu36I酶切位點(利用Bsu36I識別位點中有可變堿基)，兩個Bsu36I酶切位點之間插入一個帶有強啟動子Prrn的GFP作為反選擇標記。所有感興趣的肝臟ORF經(jīng)過PCR擴增后(引物兩端加上TTAC與TGAC接頭)，經(jīng)過T4DNApolymerase處理后直接和經(jīng)Bsu36I酶切的載體相連。 (2)利用生物信息學分析結果，選取了與代謝、物質轉運、氧化應激、信

3、號轉導、轉錄調控和細胞周期調控等相關的肝臟基因430個，用PCR方法擴增這430個基因，PCR產(chǎn)物與pDBlg相連接，并測序驗證重組質粒。 (3)430個重組質粒分別轉化Mav203后，將430個mav203(pDB-x)進行自激活驗證后，利用改進的雙雜交系統(tǒng)，篩選人類肝臟cDNA文庫，對于篩選到的陽性克隆經(jīng)質粒拯救、測序、Blast分析后共得到蛋白質相互作用對471對，再次回溯到酵母體內驗證，其陽性率約為60﹪。 (4