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文檔簡介
1、肝臟是人體最大的代謝器官,在人體中具有不可替代的重要生理功能。研究肝臟內(nèi)重要蛋白質(zhì)的相互作用是理解肝臟生理功能與分子機(jī)制的基礎(chǔ)。本論文利用改進(jìn)的高通量酵母雙雜交技術(shù)平臺來研究人肝臟重要蛋白質(zhì)的相互作用,為初步描繪人類肝臟重要蛋白質(zhì)相互作用連鎖圖打下了一定的基礎(chǔ)。其內(nèi)容主要有以下幾個方面:(1)酵母雙雜交誘餌載體pDBlg的構(gòu)建:最初的雙雜交系統(tǒng)是invitrogen公司的PROQUSTTMTwo-hybridsystem,在此將其誘餌載
2、pDBLeu載體作出了改進(jìn):在其多克隆位點(diǎn)處引入兩個識別位點(diǎn)不一樣的Bsu36I酶切位點(diǎn)(利用Bsu36I識別位點(diǎn)中有可變堿基),兩個Bsu36I酶切位點(diǎn)之間插入一個帶有強(qiáng)啟動子Prrn的GFP作為反選擇標(biāo)記。所有感興趣的肝臟ORF經(jīng)過PCR擴(kuò)增后(引物兩端加上TTAC與TGAC接頭),經(jīng)過T4DNApolymerase處理后直接和經(jīng)Bsu36I酶切的載體相連。 (2)利用生物信息學(xué)分析結(jié)果,選取了與代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化應(yīng)激、信
3、號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞周期調(diào)控等相關(guān)的肝臟基因430個,用PCR方法擴(kuò)增這430個基因,PCR產(chǎn)物與pDBlg相連接,并測序驗(yàn)證重組質(zhì)粒。 (3)430個重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化Mav203后,將430個mav203(pDB-x)進(jìn)行自激活驗(yàn)證后,利用改進(jìn)的雙雜交系統(tǒng),篩選人類肝臟cDNA文庫,對于篩選到的陽性克隆經(jīng)質(zhì)粒拯救、測序、Blast分析后共得到蛋白質(zhì)相互作用對471對,再次回溯到酵母體內(nèi)驗(yàn)證,其陽性率約為60﹪。 (4
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